通窍活血汤通过激活音猬因子信号通路减轻脑缺血后大鼠脑水肿的实验研究*

白马瑞雪 叶育锋 柏鲁宁

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712046）

脑缺血（IS）是脑血流中断引起的严重神经损伤疾病，属中医“中风”范畴。IS 的病理特征之一是血脑屏障（BBB）完整性的破坏［1］，通透性增大，使脑水肿加重［2-3］，而脑水肿是IS 最常见和最严重的并发症之一，严重影响患者预后［4］。目前临床上IS的药物治疗方法有限，迫切需要新的治疗方法。研究发现，Shh/Gli1 信号通路在IS 后表现出神经保护作用，星形胶质细胞可分泌音猬因子（Shh）上调BBB 的完整性［5-6］。中医学对中风有良好的预防和治疗作用，通窍活血汤可修复脑缺血后Claudin5（Cldn5）蛋白的结构，下调水通道蛋白4（AQP4）蛋白表达，降低BBB 的通透性［7］。但通窍活血汤是否通过激活Shh信号通路来调控BBB 的完整性，减轻脑水肿从而发挥对大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的神经保护作用，目前报道较少。本研究以MCAO 大鼠为模型，以Shh 信号通路为切入点，通过研究通窍活血汤对MCAO 大鼠BBB 相关蛋白的影响，进一步探讨通窍活血汤减轻脑缺血大鼠脑水肿的可能机制，为临床防治IS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选雄性SD 大鼠72 只，周龄（10±1）周，体质量（300±10）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（川）2022-030，在陕西省中医药管理局中药药效机制与物质基础重点研究室饲养，相对湿度45%～55%，温度20～25 ℃。适应性饲养5 d。动物实验的饲养、手术操作以及标本收集均经过陕西中医药大学伦理委员会审核通过（SUCMDL30210924001）。

1.2 实验药物

通窍活血汤：生姜50 g，赤芍30 g，人工麝香1.5 g，大枣70 枚，川芎30 g，桃仁90 g，葱30 g，红花90 g。将中药材置于10 倍量的黄酒中浸泡1 h，加热回流提取3次，每次2 h，将3 次滤液合并，蒸发，浓缩，加入黄酒稀释液和麝香，再次过滤，配制成含生药2 g/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存备用。中药饮片均购自陕西中医药大学附属医院，经陕西中医药大学药学院鉴定为正品。尼莫地平片（山西亚宝药业集团股份有限公司，国药准字号H14022821）。黄酒（绍兴柯桥第三酒厂）。

1.3 试剂与仪器

HE 染液套装、通用型组织固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号分别为：G1003、G1101）；Shh 抗体、Gli1 抗体、Cldn5 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为：20697-1-AP、66905-1-Ig、29767-1-AP）；AQP4 抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：GB11530）。水迷宫（上海吉量软件科技有限公司，型号：JLBehv-MWMG）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KD-P）；组化笔（武汉塞维尔生物科技有限公司，G6100）；显微镜（尼康仪器有限公司，型号：E100）。

1.4 分组及给药

适应性饲养5 d 后，将72 只大鼠随机分为6 组，每组12 只，即假手术组、模型组、尼莫地平组及中药低、中、高剂量组。根据人与大鼠换算比计算，连续7 d对各组大鼠进行药物干预：假手术组、模型组灌胃生理盐水6 g/kg，每日1 次；尼莫地平组灌胃尼莫地平药液10 mg/kg，每日1 次；中药低、中、高剂量组分别灌胃通窍活血汤2.9、5.8、11.6 g/kg，每日1次。

1.5 模型制备

最后1 次药物干预结束2 h 后，开始造模。大鼠术前禁食12 h，自由饮水，采用经典改良Zea-Longa 线栓法［8］制备大鼠MCAO 模型。取20%乌拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后将大鼠仰卧固定于手术台。选择大鼠颈部正中偏右备皮、消毒行纵向手术切口，钝性分离并暴露皮下组织，找到颈总动脉（CCA）交叉处，分离迷走神经、CCA、颈内动脉（ICA）与颈外动脉（ECA）。插入线栓约17～18 mm遇到阻力时停止，使线栓经CCA与ICA到达大脑中动脉，固定线栓，将CCA外多余线栓剪掉，伤口消毒缝合。假手术组大鼠仅分离血管不插入线栓，其余步骤与模型组相同。待大鼠清醒后行神经功能学评分，分值1～3 分为造模成功。对造模失败或意外死亡的大鼠，选择同批次SD大鼠按相应组别要求补足实验大鼠数量。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 神经功能学评分 造模24 h 后使用Zea-longa神经功能评分法［8］（5 级4 分法）对大鼠神经功能缺损程度进行评定。分数高低与脑功能正常与否呈反比。

1.6.2 Morris 水迷宫实验 造模前5 d 将大鼠放入水迷宫行定位航行试验，每天分别从第1、4 象限将大鼠放入水中训练2次。第6日进行空间探索实验，将平台撤离并取原平台所在对象限作为大鼠入水点。记录90 s内大鼠穿过原平台所在位置的次数及停留原平台象限所用时间。造模后24 h 再次行空间探索实验，完成后整理数据并评估造模后大鼠空间记忆能力的差异。实验过程中保证实验环境的固定和安静。

1.6.3 脑组织病理学观察 腹腔注射20%乌拉坦麻醉处死，取缺血侧海马组织用4%甲醛溶液固定24 h以上。将组织修整、标记。依次行脱水、浸蜡、包埋、切片，-20 ℃冰箱冰冻切片；脱蜡、复温固定、HE 染色、脱水、中性树脂封片，显微镜下观察。

1.6.4 免疫组织化学法检测脑组织Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表达 如前述方法取缺血侧海马组织石蜡包埋、切片后，脱蜡、抗原修复、封闭、敷一抗、敷二抗、显色、复染、脱水、封片胶封片，显微镜下观察。

1.6.5 蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测脑组织Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表达 取鲜脑后，迅速于冰袋上将缺血侧海马组织取出放入无菌EP管，置于液氮罐中，过夜后存储于-80 ℃冰箱中保存备用。检测时将海马组织研磨，加入裂解缓冲液，提取总蛋白、测定蛋白浓度、SDS-PAGE 电泳、转膜及抗体孵育、显像处理。扫描后分析胶片目的条带的灰度值。

1.7 统计学处理

应用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布且方差齐的数据，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验；非正态分布的数据采用非参数检验进行分析。计量资料均以（±s）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

见表1。造模24 h 后，假手术组大鼠神经功能评分为0 分，无神经功能缺损；模型组评分为（2.75±0.45）分，在各组大鼠中评分最高，神经功能缺损最严重，说明造模成功。与假手术组相比，模型组大鼠神经功能评分显著增高（P＜0.05）；与模型组相比，尼莫地平组及通窍活血汤中、高剂量组大鼠神经功能评分显著降低（均P＜0.05）；与尼莫地平组相比，中药中、高剂量组大鼠神经功能评分略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分、穿越平台次数和平台所在象限停留时间比较（±s）

表1 各组大鼠神经功能评分、穿越平台次数和平台所在象限停留时间比较（±s）

注：与假手术组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与尼莫地平组比较，△P ＜0.05。下同。

组 别假手术组模型组尼莫地平组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 12 12 12 12 12 12神经功能评分（分）0 2.75±0.45*1.33±0.49#2.33±0.49△1.42±0.52#1.58±0.67#穿越平台次数（次）3.33±0.78 0.92±1.00*3.08±1.44#1.33±0.78△3.25±0.87#2.31±1.35△停留时间（s）40.41±3.01 14.67±1.10*24.83±0.91#17.40±0.71#△27.49±4.52#19.64±0.73#△

2.2 各组大鼠空间记忆能力比较

见表1。经过5 d 训练各组大鼠造模前游泳轨迹差别不大。造模24 h后，与假手术组相比，模型组大鼠穿越平台次数与平台所在象限停留时间显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，尼莫地平组和中药中剂量组大鼠穿越平台次数显著增加（P＜0.05），平台所在象限停留时间显著延长（P＜0.05）；与尼莫地平组相比，通窍活血汤中剂量组大鼠穿越平台次数与平台所在象限停留时间略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠脑组织病理学

假手术组海马组织细胞形态正常，胞质胞核边界清楚，排列紧密，为细胞正常形态。模型组大鼠海马组织结构明显异常，细胞排列紊乱，可见大量细胞核破裂，核固缩深染，细胞明显水肿且大量坏死，而中药中剂量组与尼莫地平组细胞坏死现象减轻，细胞水肿程度较模型组减轻。见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理观察（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠脑组织Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白表达比较

见图2。假手术组中，海马内Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 正常表达，呈浅棕色或棕色。与假手术组相比，模型组Shh、Gli1 黄色或棕色颗粒表达略增多，蛋白表达增高不明显；Cldn5 黄色着色区域明显减少，蛋白表达显著减少；AQP4 棕色或褐色颗粒明显增多，蛋白表达显著增多。与模型组相比，尼莫地平组和中药中剂量组Shh、Gli1、Cldn5 黄色或棕色颗粒增多，表达显著增多；AQP4棕色着色变浅，表达显著减少。

图2 各组大鼠脑组织蛋白表达（免疫组化染色，200倍）

2.5 各组大鼠脑组织Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表达比较

见表2、图3。与假手术组比较，模型组Shh、Gli1表达上调（P＜0.05）；Cldn5 蛋白显著减少（P＜0.01）；AQP4 表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，尼莫地平组与中药中剂量组Shh、Gli1 表达显著上调（P＜0.01）；中药中剂量组Cldn5 蛋白表达上调（P＜0.01）、AQP4 表达下调（P＜0.01）；与尼莫地平组相比，中药中剂量组大鼠Shh、Gli1、Cldn5蛋白略高，AQP4蛋白表达略低，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。

图3 各组大鼠脑组织蛋白表达条带

表2 各组大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相对表达量比较（±s）

组 别假手术组模型组尼莫地平组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n3 3 3 3 3 3 Shh 1.00±0 1.82±0.11*3.47±0.19##2.44±0.12 4.82±0.53##3.13±0.15##Gli1 1.00±0 1.71±0.06*3.24±0.19##2.59±0.19#3.42±0.17##3.35±0.40##Cldn5 1.00±0 0.59±0.04**0.82±0.01##0.66±0.02 0.97±0.03##0.82±0.05##AQP4 1.00±0 3.05±0.59**1.74±0.25#2.47±0.42 1.34±0.20##1.99±0.30#

3 讨 论

IS 的发病率、致死率及疾病负担有逐年升高的态势，近年来已逐渐成为我国居民第一大死亡原因［9-10］。目前临床上已做出各种努力来改善中风发作后的结局，如及时的静脉溶栓治疗和机械性血栓切除术，以实现脑血管再通［11］。几乎所有无禁忌证的患者都推荐使用抗血小板或抗凝剂等抗血栓治疗［12］，但对IS 的药物治疗效果仍有限，迫切需要新的治疗方法。

局部缺血后，脑组织ATP 合成中断、能量缺乏、离子稳态受损导致BBB 结构破坏，通透性增大，导致脑水肿［2］。脑容量受到颅骨刚性的限制，即使是微小的容量增加，也会导致颅内压升高、脑疝等严重后果，故脑水肿对IS 的发病率和死亡率有重要影响［13］。中医治疗中风历史悠久，中药可通过多靶点、多途径作用于IS，临床疗效显著［14］。通窍活血汤是著名中医经典方剂，对IS有神经保护作用，已被广泛用于治疗IS患者［15］。研究发现［7］，脑缺血后，通窍活血汤可上调Cldn5表达，下调AQP4 表达，降低BBB 的通透性，减轻脑水肿，但通窍活血汤调节蛋白表达、保护BBB 的具体机制仍不清楚。

BBB是可以精确控制大脑内环境稳态的物理和生化屏障，由紧密排列的血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞等细胞组成。内皮细胞间由紧密连接（Tjs）蛋白连接，Cldn5是Tjs的主要蛋白之一，保证脑血管完整性和BBB 功能。其结构的破坏会使血管内皮细胞的细胞旁通透性增高，导致脑组织水肿；同时会使炎症因子、血浆和血清蛋白等进入中枢神经系统，导致神经炎症，进一步加重BBB 破坏，形成恶性循环［16］。研究发现，脑组织缺血缺氧使Cldn5 蛋白结构破坏，BBB 通透性增加，加重脑水肿［17］。AQP4 是大脑中主要的水通道蛋白，集中在血管周围星形胶质细胞足突上表达，兼具细胞外渗透压感受器和水平衡调节器的功能，对脑组织水分子的转运起主导作用，对维持脑组织内环境的稳定具有重要作用［18］；同时AQP4 与脑脊液的分泌和重吸收有关，而脑脊液是IS 水肿液的主要来源［19-20］。脑缺血后，星形胶质细胞内外的电解质平衡紊乱，使渗透压梯度发生变化，上调了AQP4 的表达，改变细胞膜结构，导致星型胶质细胞水肿［21］，增加了BBB 通透性和细胞水分渗透性，使血管内液体与周围脑脊液加速流入脑实质［19］。在AQP4 被抑制后，这种内流显著减少，使流向脑组织的水渗透减少，显著减轻脑水肿［22］。本实验结果显示，模型组Cldn5表达最少、AQP4 表达增强，说明模型组大鼠BBB 破坏最为严重，脑水肿程度最大；而中药中剂量组Cldn5 表达明显回升、AQP4 表达明显减少，说明通窍活血汤通过调控Cldn5 和AQP4 蛋白表达保护缺血后BBB，减轻脑水肿，改善MCAO 大鼠神经功能缺损程度与空间记忆能力。这与汪宁等［7］的研究结果一致。

Shh 信号通路在中枢神经系统发生、发育中起重要作用，该信号通路已成为治疗IS 的新靶点。脑组织缺血缺氧后，星形胶质细胞分泌Shh，与内皮细胞膜上的Ptch蛋白结合，解除Ptch对Smo蛋白的抑制，后者在初级纤毛细胞器中积累并启动下游信号通路级联，触发Gli1 的激活。Gli1 是一种转录激活因子，其存在表明细胞Shh 活性活跃［23］。研究发现，Shh 信号通路可修复MCAO动物模型的Tjs蛋白，显著减轻脑水肿和维持BBB 的通透性［24］，而Shh 信号传导抑制剂环巴胺可逆转这一作用［25］。本实验结果显示，模型组大鼠脑组织中Shh 与Gli1 蛋白表达略增多，表明仅在缺血刺激下，Shh 信号通路不能被完全激活；与模型组比较，中药中剂量组大鼠Shh 与Gli1 蛋白表达显著增多，提示通窍活血汤可在一定程度上激活Shh信号通路表达。

综上所述，通窍活血汤对MCAO 大鼠的神经保护作用可能是通过激活Shh/Gli1信号通路，调控Cldn5表达增加、AQP4 表达减少来保护BBB 完整性，达到减轻脑水肿的效果，但是其具体机制还需要进一步研究。本实验仍存在诸多不足，如实验中未应用Shh 抑制剂更进一步说明通窍活血汤可激活Shh 通路发挥作用。我们将在后续的实验中进一步研究他们之间的关系。