饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病进展中糖代谢酶的变化*

李超波， 杨丽媛， 王春梅， 宋井一， 郝艳艳， 曹立瀛， 马向明

（华北理工大学附属开滦总医院 肝胆外科，河北 唐山 063000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）是目前最常见的慢性肝病，影响了全球约30%的人口［1］。约20%~30%的NAFLD患者会从早期的非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver， NAFL）进展为非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH），并最终可能发展为不可逆的肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）［2］。NAFLD的发病机制最初被描述为“双重打击”学说，最近的研究结果描述了一种“多重打击”学说，其中多个平行的致病事件协同作用［3］，糖代谢重编程导致的脂质沉积、纤维化和肝星状细胞的激活可以作为平行事件来推动NAFLD的进展［4-5］。流行病学研究表明，代谢相关疾病也是NAFLD患者发生HCC的高危因素［6］，因此高脂饮食（high-fat diet， HFD）诱导的肝脏脂代谢紊乱与糖代谢重编程可能是促进NAFLD发生的因素之一。目前，对NAFL向NASH进展的糖代谢变化的了解并不完整，我们构建了一个NAFLD模型，探讨糖代谢途径在NAFL向NASH进展过程中的变化及意义。

材料和方法

1 实验动物

48只3周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司［实验动物合格证编号：110322220101862816，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008］，饲养于华北理工大学附属开滦总医院肝胆病研究所动物饲养室，环境温度控制在（23±2） ℃，湿度控制在40%~60%，自由进食进水。所有的动物实验都是在华北理工大学附属开滦总医院实验动物伦理委员会批准下进行的。

2 主要试剂

总胆固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase， AST）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖检测试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司）；改良油红O染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒和超敏ECL化学发光试剂盒（河北瑞帕特生物科技有限公司）；RIPA裂解液（强）购自上海碧云天生物技术有限公司；Immobilon®-P PVDF膜（Millipore）；丙酮酸激酶M1（pyruvate kinase M1， PKM1）和β-肌动蛋白（β-actin）抗体（Cell Signaling Technology）；丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase， PC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1， PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（glucose-6-phosphatase catalytic subunit， G6PC）抗体（ABclonal）；磷酸果糖激酶B（phosphofructokinase B， PFKB）、乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A， LDHA）、果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1， FBP1）、PKM2、己糖激酶1（hexokinase 1， HK1）和HK2抗体（杭州华安生物技术有限公司）。

3 主要仪器

HistoStar石蜡包埋机和Gemini AS全自动染色机（Thermo Fisher）；Sunrise酶标仪（Tecan）；低温离心机（无锡德凡仪器有限公司）；HistoCore PEARL组织脱水机、HistoCore BIOCUT旋转式切片机、CM1950型冰冻切片机（Leica）；全自动凝胶成像仪（上海嘉鹏科技有限公司）；Axio Scope.A1光学显微镜（Carl Zeiss）。

4 分组、造模及取材

所有小鼠适应性喂养3 d后随机分为对照饮食（control diet， CD）组（n=24）和HFD组（n=24）。CD组给予10%脂肪供能的普通对照饲料（XTCON50J：10%脂肪、70%碳水化合物和20%蛋白质；江苏省协同医药生物工程有限责任公司），HFD组给予60%脂肪供能的胆碱缺乏饲料（XTCD60：60%脂肪、20%碳水化合物和20%蛋白质；江苏省协同医药生物工程有限责任公司）。两组均在给予相应饲料喂养后8、12、16和20周分4批次处死小鼠，每次6只，处死前禁食12 h，予七氟烷吸入麻醉后摘除眼球取血，室温静置3 h后4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，分装后-80 ℃冻存备用。颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏后称重，取部分肝脏组织制备石蜡块以及冰冻切片。剩余组织分装后-80 ℃冻存备用。

5 主要方法

5.1 肝组织HE染色 小鼠肝脏在4%中性甲醛溶液中固定24 h以上，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，包埋后的石蜡块切成4 um的厚度，烤片30 min，使用全自动染色机进行HE染色，用光学显微镜阅片并进行NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS），NAS≥5时可诊断为NASH［7］。

5.2 肝组织油红O染色 新鲜肝组织在冰冻切片机中切成8 um的厚度，根据油红O染色试剂盒说明书进行油红O染色，染色完成后光学显微镜观察及拍摄。

5.3 小鼠血清学指标检测 取适量血清根据试剂盒说明书检测TC、TG、ALT、AST和葡萄糖水平。

5.4 Western blot检测 取约40 mg肝组织，加入10倍体积RIPA裂解液及1% PMSF，使用玻璃匀浆器冰上匀浆；冰上静置30 min后4 ℃、12 000 r/min离心10 min；取上清，BCA法测定蛋白浓度；加入5× loading buffer和RIPA裂解液进行浓度均一化，使用SDSPAGE分离蛋白；电转至PVDF膜上，用TBST稀释的5%脱脂牛奶室温封闭1 h；将PVDF膜和封闭液稀释的Ⅰ抗在4 ℃下孵育过夜；次日，TBST洗膜后使用封闭液稀释的Ⅱ抗室温孵育1 h；TBST洗膜后ECL发光液进行免疫印迹可视化并拍摄；使用Photoshop 2021软件对蛋白条带进行组图并使用ImageJ软件对蛋白灰度值进行测量。

6 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析及作图。对计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Pearson相关法。P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 HFD喂养的小鼠16周时出现明显的肝脏脂质蓄积

HFD组小鼠在喂食HFD后第4周体重开始明显增加，到第16周显著高于CD组（P<0.01），见图1A。HFD组小鼠肝重到16周显著高于CD组（P<0.01），见图1B。HFD组肝脏指数（肝重/体重）在16周后大于CD组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图1C。相比CD组，HFD组喂食16周时可见肝脏变大且颜色变浅，见图1D。HE染色显示，16周CD组肝细胞排列整齐，结构清晰，胞内无脂肪空泡出现，而16周HFD组存在分布广泛的大小不等的脂肪空泡；油红O染色显示，16周HFD组中存在大量橘红色脂滴，见图1E。这些数据表明，HFD喂养的小鼠到16周时表现出明显的肝脏脂质蓄积。

Figure 1. Mouse body weight （A）， liver weight （B）， liver index （C）， liver gross appearance at 16 weeks （D）， and HE and oil red O staining of liver tissues at 16 weeks （E， ×200）. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group.图1 小鼠体重、肝重、肝脏指数、16周肝脏外观及16周肝组织HE和油红O染色图

2 HFD组小鼠在16周时出现外周血糖脂代谢紊乱并大部分进展为NASH

HFD组小鼠血清TC水平在16周后显著高于CD组（P<0.05），而血清ALT和血糖水平在12周以后较CD组显著升高（P<0.05），见图2A~C。另外在所有实验时间内两组血清TG和AST水平差异均无统计学意义（P>0.05），见图2D、E。小鼠肝脏在第8周时出现大-微泡性脂肪变性，并在随后的实验期间进展到更严重的地步（图2G），这些结果与之前的研究类似［8］。根据NAS评估小鼠肝脂肪变性、小叶炎症和气球样变［7］，结果显示HFD组小鼠在16周时大部分表现为NASH（图2F），与肝重（图1B）增长时间一致，HFD组各阶段的油红O染色（图2G）与此表现一致。这些数据表明，高脂喂养的小鼠外周血主要在16周后发生糖脂紊乱，而肝组织脂肪病变在8周甚至更早期就已经开始，在16周时大部分进展为NASH。

Figure 2. Serum levels of total cholesterol （TC； A）， alanine aminotransferase （ALT； B）， glucose （C）， triglyceride （TG； D） and aspartate aminotransferase （AST； E）， hepatic NAFLD activity score （NAS； F）， and representative images of HE and oil red O staining （G， ×200） in mice at different time points. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs CD group.图2 小鼠各阶段血清TC、ALT、葡萄糖、TG、AST水平及肝脏NAS、HFD组HE染色和油红O染色图片

3 小鼠糖酵解酶表达水平

上述实验结果提示HFD组小鼠在16周时出现明显的NASH改变并伴随外周血糖脂紊乱，通过Western blot检测16周CD组和HFD组小鼠肝糖酵解酶的蛋白表达水平发现，与16周CD组相比，HFD组小鼠肝糖酵解关键酶HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01），PFKB和PKM1蛋白表达基本不变（P>0.05），见图3A。HK2和PKM2亚型的表达与有氧糖酵解密切相关［9］，为了进一步明确糖酵解酶的表达趋势，对第8、12、16和20周HFD组小鼠肝糖酵解酶表达进行检测，发现HK2、PKM2和LDHA蛋白表达水平都随着NAFLNASH进展而升高（P<0.01），见图3B。这些结果提示，HFD诱导的小鼠肝内有氧糖酵解增加且与NAFL向NASH进展有关。

Figure 3. Protein expression levels of glycolytic enzymes， hexokinase 1 （HK1）， HK2， phosphofructokinase B （PFKB）， pyruvate kinase M1 （PKM1）， PKM2 and lactate dehydrogenase A （LDHA）， in mouse liver tissues. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs CD group； ##P<0.01 vs 8 weeks.图3 小鼠肝组织糖酵解酶蛋白表达水平

4 小鼠糖异生关键酶表达水平

与糖酵解关键酶表达水平的升高相反，与16周CD组相比，HFD组小鼠肝糖异生关键酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白表达水平显著降低（P<0.01），PC蛋白表达水平基本不变（P>0.05），见图4A。同样，对第8、12、16和20周HFD组小鼠肝糖异生关键酶表达进行检测，在NAFL向NASH的进展中，PCK1蛋白表达水平逐渐降低（P<0.01），PC蛋白表达水平逐渐升高（P<0.05），FBP1蛋白表达水平未出现显著改变（P>0.05），与LDHA类似，G6PC蛋白表达水平主要从第12周就显著升高（P<0.05），见图4B。这些结果提示，HFD诱导的小鼠肝内糖异生酶表达水平降低且与NAFL向NASH进展有关。

Figure 4. Protein expression levels of key gluconeogenic enzymes， glucose-6-phosphatase catalytic subunit （G6PC）， fructose-1，6-bisphosphatase 1 （FBP1）， phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 （PCK1） and pyruvate carboxylase （PC）， in mouse liver tissues. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group； #P<0.05， ##P<0.01 vs 8 weeks.图4 小鼠肝组织糖异生关键酶蛋白表达水平

5 NAFLD小鼠肝组织糖代谢酶蛋白表达水平与NAS的相关性

小鼠肝组织糖代谢酶PKM2、LDHA、G6PC、PCK1和PC在NAFL向NASH进展中的表达水平与NAS存在显著相关性（P<0.05或P<0.01），而HK2与NAS的相关性无统计学意义（P>0.05），其中PKM2、PCK1和PC与NAS存在强的正相关或负相关，见表1。

表1 NAS与糖代谢酶蛋白表达水平的相关性Table 1. Correlations between NAFLD activity score （NAS） and the protein levels of glucose metabolism enzymes

讨论

NAFLD通常合并有代谢综合征，如2型糖尿病、全身性高血压、血脂异常和胰岛素抵抗等，而代谢重编程在NAFLD中导致了脂质在肝脏内的异常积累、炎症反应的增加以及肝细胞受损［10］。本研究中HFD组小鼠饮水中并未添加果糖/葡萄糖，HFD组数据可准确反映HFD对糖代谢的影响。同时，HFD中缺乏胆碱，这会导致极低密度脂蛋白生成障碍，从而加快肝脏中甘油三酯蓄积，但外周血中甘油三酯并不会明显增加，这与我们的研究一致。本研究发现，12周后在HFD组小鼠中观察到外周血糖脂代谢紊乱，在16周时肝脏变大且颜色变浅，NAS提示肝脏在16周时大部分进展为NASH，而肝脏脂肪变性>50%时才会表现出明显的肝脏肥大［11］，表明随着NAFL向NASH的进展，除了肝脏脂质蓄积明显增加外，也会导致外周血糖脂紊乱。

为了进一步明确HFD是否会导致肝脏出现糖代谢重编程，我们检测了小鼠肝脏糖酵解和糖异生相关酶的蛋白表达水平。结果发现，HFD组小鼠肝脏HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表达在16周时明显升高，对随饮食时间梯度的HFD组小鼠肝脏糖酵解酶蛋白表达检测发现，HK2、PKM2和LDHA与NAFL向NASH的进展趋势相同，而后两者与NAFLD进展存在显著相关性，特别是PKM2，提示HFD会持续诱导肝脏的有氧糖酵解。研究表明，有氧糖酵解的多种底物可以促进脂肪从头生成［12］，抑制脂肪从头合成也会导致糖酵解和血糖的降低［13-14］。此外，PKM2的增加与肝巨噬细胞和特异性Kupffer细胞的M1极化密切相关［15］。M1型巨噬细胞释放的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6（interleukin-6， IL-6）和IL-1β会刺激肝星状细胞活化，促进脂肪分解，与HCC发病有关［16-17］。PKM2的共价抑制会促进巨噬细胞从M1型向M2型极化的转变，对抗NAFLD的发展［17］。NAFLD患者Rouxen-Y胃绕道手术后肝脂肪含量和炎症的减少也与肝脏和血清中PKM2的减少有关［18］。而HK2和乳酸表达增加导致的组蛋白乳酸化是肝星状细胞激活的关键［19］。这些研究表明，HK2、PKM2和乳酸是肝脏脂肪生成、炎症、纤维化及HCC进展的重要共同因素。因此，在不去除外源性脂肪摄入的情况下，肝脏脂质摄入和有氧糖酵解可能互相加重，共同导致NAFL向NASH甚至HCC进展。

在肝脏的糖异生代谢方面，我们发现，HFD组小鼠肝脏糖异生关键酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白在16周时表达水平均下降，表明在NASH的早期阶段空腹时抑制了糖异生酶的表达，但HFD组小鼠空腹血糖并没有明显降低，提示糖异生通量是增加的。隔夜禁食后空腹血糖的来源主要为肝糖异生［20］，糖异生通量是胰岛素、升糖激素和糖异生底物共同作用的结果，NASH进展中的胰岛素抵抗会导致胰岛素分泌的增加，而胰岛素可以抑制G6PC、PCK1和FBP1表达［21-23］。同时，胰岛素抵抗也会进一步导致白色脂肪组织脂解释放甘油和游离脂肪酸增加［24］。Kalemba等［25］研究发现，甘油的糖异生作用要显著高于丙酮酸和乳酸，同时还会促进G6PC和抑制PCK1，与本研究中G6PC和葡萄糖增长趋势一致，这也解释了为什么PCK1蛋白表达明显低于G6PC和FBP1。最近也有研究发现，特异性敲除小鼠肝脏PCK1基因会导致以3-磷酸甘油为底物的脂质合成和摄取途径明显增加并促进肝星状细胞的激活［5］，表明甘油的肝内糖异生与丙酮酸的肝内糖异生在某些情况下可能存在相互抑制。此外，PC主要受底物乙酰辅酶A的调节［26］，而肝脏脂肪的不断蓄积和胰岛素抵抗的增加使肝脏中脂肪酸β氧化不断增加，乙酰辅酶A浓度也不断增加［27］，因此甘油和脂肪酸不断增加使PCK1逐渐下降和PC逐渐上升，这与本研究发现的PC和PCK1分别与NAFLD的进展存在正负相关性的结果一致。

本研究所用的小鼠模型可部分代表人类NAFLD的肝脏病理生理改变［28］，一定程度上也表明了单纯HFD对肝脏糖代谢酶蛋白水平的改变，但现代社会食物中包含着大量的葡萄糖/果糖，这可能导致代谢模式的差异，而在肿瘤中的差异可能更明显［29-30］。总之，高脂喂养的小鼠在NAFL向NASH进展中发生了糖酵解和糖异生关键酶的改变，这些酶的改变可能进一步促进了肝脏脂质蓄积、炎症和纤维化的进展，甚至可能与肝脏的脂质蓄积和炎症共同作用而导致HCC的发生发展；对表达有明显差异的酶的调控，特别是PKM2和PCK1，可能有助于抑制NAFL向NASH的进展。