禽传染性支气管炎病毒拮抗JAK-STAT信号通路的研究

楚红燕，宫晓倩，徐丘璠，仇旭升，谭 磊，孙英杰，刘炜玮，宋翠萍，钱 琨，丁 铲，廖 瑛，陈丽颖

（1.河南农业大学动物医学院，郑州 450002；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 江苏省人兽共患病学重点实验室，扬州 225009）

传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科，γ冠状病毒属，具有多种血清型，在养禽业中流行多年，对鸡呼吸道、肾脏、输卵管等器官造成严重的损伤，主要引起产蛋率下降[1]。1936年分离出以Mass株和Conn株为代表的呼吸型IBV，其临床诊断特征是病鸡精神沉郁、呼吸困难、发出啰音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏[2]。1962年，Winterfield等[3]首次报道分离到Holte株和Gray株为代表的肾型IBV，以肾病变为主，呼吸道症状较轻微，其病变特征是肾肿大、苍白、肾小管和输尿管充满尿酸盐。肾型IBV以QX株、Holte株、Gray株和T株为代表分离株。目前，肾型QX株、呼吸型Mass株和肌肉型4/91株在我国鸡场流行，同时也存在变异株[2]。IBV的基因组为单股正链RNA，长度约为27.6 Kbp，由10个开放阅读框架（open reading frame,ORF）组成。5'端三分之二序列是开放读码框架ORF1a和ORF1ab，翻译合成两个多聚蛋白pp1a和pp1ab（polyprotein 1a and polyprotein 1ab)，由多聚蛋白自身编码的两个非结构蛋白（nonstructural protein,nsp）：木瓜样蛋白酶（papain-like protease,nsp3）和3CL蛋白酶（3C-like protease,nsp5）切割产生15个成熟的非结构蛋白（nsp2～nsp16）[4]。这些非结构蛋白包括蛋白酶（nsp3、nsp5）、RNA复制酶（nsp12）、RNA解旋酶（nsp13）、核酸外切酶（nsp14）、核酸内切酶（nsp15）和RNA甲基化酶（nsp16）等，参与病毒的复制，并在病毒-宿主相互作用中发挥重要作用[5]。基因组3'端的三分之一序列编码4个结构蛋白：纤突蛋白（spike protein,S）、小包膜蛋白（envelope protein,E）、膜蛋白（membrane protein,M）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）和4个辅助蛋白3a、3b、5a和5b、M蛋白和E蛋白参与病毒颗粒的组装和释放，N蛋白跟基因组RNA结合形成核衣壳，保护病毒基因组，S蛋白介导病毒入胞，并决定病毒的感染物种和组织嗜性。4个结构蛋白均为感染性病毒颗粒的重要组成部分[1]；推测4个辅助蛋白跟病毒的毒力相关[5]。

在病毒感染期间，通常激活转录因子IRF3/IRF7，诱导I型干扰素（IFN-α和IFN-β）的表达。IFN-α和IFN-β是主要的抗病毒细胞因子，是动物先天免疫防御的重要组成部分，在控制病毒感染和引发适应性免疫应答中至关重要[6]。IFN-α和IFN-β分泌到细胞外，与细胞表面的IFN受体（IFNAR-1和IFNAR-2）相结合，激活Janus激酶JAK1和TYK2[7]；随后，活化的JAK激酶磷酸化转录因子STAT1和STAT2，与IRF9形成转录复合体，进入细胞核，诱导几百种抗病毒因子干扰素诱导基因ISGs（interferon stimulated genes）的表达[8]。与哺乳动物的冠状病毒相似，γ型禽冠状病毒IBV已经进化出多种策略来有效地拮抗禽类宿主的干扰素反应，抑制抗病毒免疫应答[9]。然而，IBV拮抗干扰素反应的机制，尚不清楚。

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于α冠状病毒，主要引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED），是一种高度传染性肠道疾病，引起仔猪严重腹泻[10]，死亡率高达100%，并影响母猪的产仔[11]。尽管已有多种疫苗可供使用，但疫情仍在持续，给养猪业带来严重的经济损失[12-14]。已有研究报道，PEDV能够通过3CL蛋白酶诱导STAT1的降解，抑制ISGs的表达，减少宿主的抗病毒反应[15]。在本研究中，PEDV将作为拮抗JAK-STAT信号通路的阳性对照，纳入实验。

为研究IBV拮抗JAK-STAT信号通路的机制，我们首先检测IBV感染是否激活JAK-STAT信号通路，并且证实IBV对IFN-β激活的JAK-STAT信号通路具有抑制作用。此外，我们还纳入nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒rIBV-nsp15-H238A，发现此毒株跟野生型IBV一样，能抑制STAT1和STAT2的磷酸化。然而，通过外源表达nsp15，检测STAT1的表达水平和核转位，发现nsp15能够减少STAT1的表达，从而减少进入细胞核的STAT1，说明nsp15参与拮抗JAKSTAT信号通路。然而，nsp15功能缺陷型毒株rIBVnsp15-H238A对JAK-STAT信号通路的拮抗，说明nsp15在病毒拮抗JAK-STAT信号通路中不发挥主要作用；病毒还编码其他的蛋白，抑制JAK-STAT信号通路。

1 材料及方法

1.1 细胞株与毒株Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）购自ATCC（美国），并保存于本实验室。其中，培养于10%血清的DMEM中。病毒：IBV Beaudette株，由华南农业大学刘定祥老师实验室馈赠。rIBV-nsp15-H238A病毒由本实验室保存。PEDV HLJBY株由扬州大学郇长超老师馈赠。

1.2 抗体与试剂鼠源Flag标签抗体（F1804）购自Sigma公司；用于质粒转染的转染试剂Fugene（E2311）购自Promega公司。IBV nsp15蛋白抗体（鼠源）由浙江大学周继勇和廖敏实验室馈赠；鼠源PEDV N蛋白抗体由中国农业科学院上海兽医研究所周艳君老师馈赠；兔源STAT1（D1K9Y）、兔源STAT2（D9J7L）和phospho-STAT1（58D6 Tyr701）、兔源phospho-STAT2（Y690 D3P2P）以及兔源HA标签（C29F4）抗体均购自CST公司；鼠源β-actin抗体（AC026）、HRP羊抗兔IgG（H+L）（AS014）和HRP羊抗鼠IgG（H+L）（AS003）购自Abclonal公司；Alexa Fluor羊抗兔488（A-11034）和羊抗鼠594（A-11005）购自Invitrogen公司；Recombinant Human IFN-beta Protein（8499-IF）购自R&D Systems。

1.3 质粒构建质粒：pXJ40F、pXJ40F-nsp15、pXJ40F-nsp15-H223A、pXJ40F-nsp15-H238A、pXJ40F-nsp15-D223A、pXJ40F-nsp15-D315A均带Flag标签，由本实验室构建并保存。根据 GenBank 上公布的鸡源STAT1基因组设计用于构建真核HA标签质粒的引物。所用载体为PCMV-HA，限制性内切酶限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ购自Thermo公司，引物序列见表1。通过DF-1细胞提取RNA，按照RNA 2 μg、Oligo dT 2 μL，反转录酶1.5 μL，dNTP 2 μL，反转录酶抑制剂1 μL，Buffer 10 μL，DEPC水补加至50 μL。42℃进行反转录2 h，75℃灭活反转录酶5 min，得到cDNA。使用Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase 进行PCR扩增所需的STAT1序列。PCR反应体系为：cDNA 5 μL，上、下游引物2 μL，缓冲液2× Max buffer 25 μL，Phanta®Max Super-FideLity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O补至50 μL。取PCR扩增产物进行琼脂糖核酸电泳检测，胶回收目的片段，酶切产物和载体PCMV-HA酶切产物按照南京Vazyme（C115）试剂盒说明书37℃连接30 min。将10 μL连接产物转化、涂板、挑菌、菌液送测序。测序正确后接菌，摇菌，最终提取质粒。

表1 构建鸡源STAT1所用引物Table 1 Primers used to construct chicken STAT1 plasmids

1.4 质粒的转染将Vero细胞接种于12孔的细胞培养板内，待细胞长至60%～70%时转染1 μg质粒（共转染组加入各1 μg质粒），具体如下：加入50 μL Opti-MEM™（共转染组加入100 μL Opti-MEM™）于EP管内，按照质粒和转染试剂的质量体积比1∶3，轻轻吹打混匀后室温静置15 min，静置期间用PBS洗3次细胞板，然后加入450 μL Opti-MEM™无血清培养基于细胞培养板内，再加入质粒-转染试剂脂质体。

1.5 Western blotVero细胞接种至12孔板，待长至70%～80%，加入不含血清的培养基稀释好的每孔1 MOI的IBV，10 MOI rIBV-nsp15-H238A，或1 MOI PEDV，同时设置不加毒的空白对照组（Mock）。接毒后将细胞放置37℃培养箱培养1 h，换含2%血清的维持培养基培养18 h，IFN-β（1000 IU/ml）刺激1 h。每孔加入100 μL的2×细胞裂解液，转移至EP管，100℃金属浴煮沸10 min，最后12 000 ×g离心5 min得到所需检测样品。将10%蛋白胶置于电泳槽内，加入1×电泳缓冲液。80 V电压30 min使样品跑至分离胶处，调整电压到120 V 75 min。按照滤纸-蛋白胶-硝酸纤维素膜-滤纸的顺序制备夹心三明治，在250 mA下转印95 min。转印结束后将硝酸纤维素膜放置在含有5%脱脂乳的孵育盒内封闭1 h。封闭结束后，用TBST洗涤一遍，孵育一抗（anti-STAT1、anti- phospho-STAT1、anti-STAT2、anti- phospho-STAT2、anti-IBV N、anti-PEDV N、anti-HA、anti-Flag或anti-β-actin），4℃孵育过夜。次日用TBST洗膜；然后将膜放入稀释好的HRP标记的二抗孵育管内，室温孵育2 h。TBST洗3遍后，在膜上均匀加入显色液，置于化学发光仪上进行显色。

1.6 间接免疫荧光实验在12孔板里加入爬片，正常接种细胞，按照如上方法处理细胞。收样时加入500 μL/孔的4%多聚甲醛固定10 min，TBS清洗一遍后，加入0.5%的Triton X-100透化10 min，洗一遍后，加入3%BSA，37℃封闭1 h。结束后，将稀释好的一抗（包括anti-IBV nsp15、anti-PEDV N、anti-STAT1、anti-Flag或anti-HA）滴加在湿盒上50 μL/片，将有细胞的一面与抗体液滴接触，然后将其放置37℃水浴箱孵育1 h。TBS洗3次，每次5 min。将盖玻片有细胞的一面与稀释好的偶联FITC或TRITC的二抗的液滴接触，避光37℃孵育30 min。TBS清洗后按照如上方式继续孵育一抗和二抗。抗体孵育工作结束后，稀释DAPI（1∶1000），每孔加入DAPI稀释液1 mL/孔，室温孵育10 min，TBS洗3遍。最后，在载玻片上滴加一滴抗淬灭剂。室温自然风干，最后在Zeiss激光共聚焦显微镜下观察和拍照摄片。

2 结果

2.1 IBV感染不刺激JAK-STAT信号通路，并能下调IFN-β激活的STAT1和STAT2磷酸化水平已有报道显示冠状病毒编码的核酸内切酶nsp15通过减少双链RNA的累积，拮抗IFN-β反应[16]。为检测nsp15是否参与对JAK-STAT信号通路的调控，将rIBVnsp15-H238A（nsp15核酸酶活性缺陷型重组病毒）纳入本实验。也有文献报道PEDV感染能够显著降低STAT1的蛋白水平[15]，将其作为阳性对照组纳入本实验。在IFN-β缺陷型细胞Vero上分别感染IBV，rIBV-nsp15-H238A，PEDV感染后24 h，一组不加IFN-β刺激，另一组加1000 IU/mL IFN-β刺激1 h。通过Western blot检测STAT1和STAT2的磷酸化水平（图1），对IBV N蛋白和PEDV N蛋白检测显示，3个毒株均能有效感染Vero细胞；检测STAT1和STAT2的磷酸化水平显示，在没有IFN-β刺激的情况下，3个毒株均不诱导STAT1和STAT2的磷酸化。在IFN-β刺激的细胞中，PEDV显著降低STAT1和STAT2的磷酸化水平，IBV和rIBV-nsp15-H238A轻度抑制STAT1和STAT2的磷酸化。本实验说明IBV感染在一定程度上抑制IFN-β诱导的STAT1和STAT2的磷酸化，nsp15的核酸酶活性在病毒对JAK-STAT信号通路的抑制中，不起主要作用。

图1 IBV感染抑制IFN-β激活的JAK-STAT信号通路Fig.1 IBV infection inhibits IFN-β stimulated STAT1/2 phosphorylation

2.2 IBV抑制IFN-β刺激的STAT1核转位为进一步确认IBV对STAT1的抑制作用，我们用间接免疫荧光检测在IBV感染情况下，STAT1的核转位情况。本实验纳入模拟感染（Mock）和PEDV感染作为对照组。在Vero细胞上分别感染1 MOI IBV、10 MOI rIBV-nsp15-H238A和1 MOI PEDV。感染后24 h，一组实验不加IFN-β，另一组实验加入IFN-β刺激1 h，利用免疫荧光技术对病毒蛋白和STAT1的核转位进行检测。以IBV nsp15抗体标记IBV感染的细胞，以PEDV N抗体标记PEDV感染的细胞，以STAT1抗体标记STAT1的核转位。在无干扰素刺激的情况下，IBV和rIBV-nsp15-H238A有效感染细胞，且均不诱导STAT1的核转位（图2A），IFN-β刺激有效诱导STAT1的核转位（图2B），IBV和rIBV-nsp15-H238A感染的细胞，在IFN-β刺激下，STAT1不发生核转位（图2B红色箭头）。此结果说明IBV感染不激活JAK-STAT信号通路，且能够显著抑制IFN-β刺激的JAK-STAT信号转导。nsp15的核酸酶活性在IBV拮抗JAK-STAT信号通路中是非必需的。PEDV感染也能在一定程度上抑制IFN-β刺激的STAT1核转位，但抑制作用不如IBV明显。

图2 IBV和rIBV-nsp15-H238A感染Vero细胞，抑制IFN-β诱导的STAT1核转位Fig.2 IBV and rIBV-nsp15-H238A inhibit IFN-β-stimulated STAT1 nuclear translocation in Vero cells

2.3 IBV nsp15减少STAT1的蛋白表达为进一步确认IBV nsp15是否参与拮抗JAK-STAT信号通路，我们对nsp15进行克隆，并把核酸内切酶活性中心H238突变为A，使其失去核酸酶活性。将IBV nsp15和突变型nsp15-H238A转染到Vero细胞，24 h后，以IFN-β刺激1 h，诱导STAT1的核转位。将不做任何处理的细胞（Mock）、IFN-β刺激、空载体PXJ40转染加IFN-β刺激，作为对照组。利用免疫荧光技术，以Flag抗体标记表达nsp15的细胞，以STAT1抗体标记内源性STAT1。Mock组的细胞质和细胞核均分布有STAT1，IFN-β处理有效刺激STAT1进入细胞核，转染PXJ40加IFN-β刺激组，STAT1主要集中在细胞核；表达nsp15的细胞，STAT1在细胞质和细胞核的信号均显著减弱；表达nsp15-H238A的细胞，STAT1主要集中在细胞核，STAT1信号较强。此实验说明nsp15有可能干扰STAT1的表达或促进其降解，导致STAT1的信号变弱，其核酸酶活性参与此功能（图3）。我们未发表的数据表明，nsp15能够广谱性抑制细胞内蛋白翻译，因而减少STAT1的蛋白表达。

图3 外源表达的IBV nsp15减少内源性STAT1的信号，且核酸酶活性发挥重要作用Fig.3 Exogenous expression of IBV nsp15 reduced endogenous STAT1 signal,and the ribonuclease activity was required

2.4 IBV nsp15抑制STAT1的表达，且核酸酶活性和nsp15的三聚化发挥关键作用为了进一步验证nsp15是否通过抑制蛋白表达而减少STAT1的信号强度，我们将nsp15-Flag和鸡源STAT1-HA在Vero细胞共表达，用IFN-β刺激1 h，检测STAT1信号强度和核转位现象。H223和H238是预测的核酸酶活性中心，D285和D315参与nsp15的三聚化，使其维持正常的结构，发挥核酸酶功能。我们将H223、H238、D285和D315分别突变成A，使其失去核酸酶活性或三聚化能力，纳入本实验。空载体PXJ40与STAT1共转染加IFN-β刺激，作为对照组。利用Western blot和间接免疫荧光检测nsp15和STAT1的表达，并检测STAT1的核转位。图4B所示，PXJ40与STAT1共转染组，IFN-β有效诱导STAT1的入核；共表达nsp15与STAT1的细胞，STAT1信号显著减弱（图4A，4B）；nsp15-H223A、nsp15-H238A、nsp15-D285A或nsp15-D315A与STAT1共转染的细胞，STAT1的表达水平跟PXJ40与STAT1共转染组相当（图4A），且主要集中在细胞核（图4B）。此实验说明nsp15干扰STAT1的表达或促进其降解，其核酸酶活性中心和三聚化，发挥关键作用。值得注意的是，nsp15-D285A和nsp15-D315A表达水平低于野生型nsp15、nsp15-H223A和nsp15-H238A（图4A），说明这两个突变体，失去三聚化后，不稳定，容易发生降解。在IBV感染过程中，由于存在其他的与nsp15相互作用的病毒蛋白，nsp15在细胞质形成点状聚集，主要位于病毒的复制转录小体[16]（图2）；然而，外源表达的nsp15进入细胞核（图3、图4B），不能被三聚化的突变体nsp15-D285A和nsp15-D315A，失去了明显的核定位（图4B），说明nsp15的三聚化跟核定位相关，也间接说明nsp15的三聚化和入核，均有可能参与抑制蛋白的表达。

图4 IBV nsp15减少外源的STAT1表达和核转位,且核酸酶活性发挥重要作用Fig.4 IBV nsp15 reduces the expression and nuclear translocation of exogenous STAT1,and ribonuclease activity plays crucial role

3 讨论

先天性免疫应答是抵抗病毒的第一道防线，而I型IFN是这种抗病毒应答的关键组成部分。STAT1是JAK-STAT信号通路的重要成分，IFN-α/β结合细胞膜上相应的IFN受体，激活JAK，刺激STAT1的磷酸化，并磷酸化STAT2；STAT1、STAT2和IRF9形成异源三聚体复合物，进入细胞核，诱导ISGs的表达，执行抗病毒作用。为了逃避宿主的先天性免疫应答，冠状病毒采用多种策略拮抗IFN信号通路，促进其自身复制。由于STAT1和STAT2的磷酸化激活和核转位是JAK-STAT信号通路的关键步骤，因此STAT经常被病毒编码的蛋白靶向抑制[5]。麻疹病毒利用其自身表达的P和V蛋白对抗IFN传导的JAKSTAT信号通路[7]；干扰STAT1磷酸化[9,17-18]；并通过降解STAT1抑制IFN-β信号传导[19]。PDCoV感染通过其自身编码的3C like蛋白酶（nsp5）剪切STAT2，拮抗IFN信号转导[20]。已有报道表明，SARS-COV-2的ORF6同时抑制I型IFN的产生和下游JAK-STAT信号传导，并且ORF6的C端区域对其拮抗作用至关重要[21]；β冠状病毒SARS-CoV的ORF6能通过将核导入因子滞留在粗面内质网/高尔基体膜上而拮抗STAT1功能[22]。IBV属于γ冠状病毒，不编码ORF6，是否编码其他蛋白，参与抑制IFN信号通路呢？

本研究中，我们用IBV Beaudette株感染Vero细胞，发现IBV不激活且能抑制IFN-β诱导的STAT1和STAT2磷酸化，并抑制STAT1的核转位。Nsp15是冠状病毒编码的核酸内切酶，能够剪切病毒的负链RNA，减少双链RNA的累积，逃逸宿主对病毒感染的识别和减少IFN的表达[16]。利用nsp15核酸酶活性缺失毒株rIBV-nsp15-H238A感染Vero细胞，发现其对JAK-STAT的抑制作用跟野生型IBV相当，说明nsp15的核酸酶活性，对于IBV拮抗JAK-STAT信号通路，不是必需的。通过外源表达nsp15，检测内源性STAT1的核转位，发现nsp15能降低内源性STAT1的蛋白信号，核内STAT1信号也相应减弱。通过共转染nsp15和STAT1质粒，检测质粒表达的STAT1信号和核转位情况，发现nsp15也能够抑制外源性STAT1的表达。我们的未发表数据显示，nsp15能够广谱性抑制细胞内蛋白翻译，因此，nsp15对STAT的抑制，有可能是其抑制宿主蛋白翻译的一个结果。对nsp15进行核酸酶活性关键氨基酸突变和三聚化关键氨基酸进行突变，结果显示其核酸酶活性和三聚化能力都参与抑制STAT1的表达。根据nsp15靶向降解RNA的特性，我们推测nsp15有可能作用于宿主RNA，抑制蛋白翻译。外源表达的nsp15能够进入细胞核，进一步证实了这个推测：nsp15靶向细胞核内RNA，因而抑制宿主mRNA的翻译。在病毒感染的情况下，nsp15主要在细胞质形成点状聚集，位于病毒基因组的复制转录复合体[16]，说明在病毒感染的情况下，细胞内环境更为复杂，nsp15的功能受其他病毒蛋白的调控，nsp15缺陷型毒株rIBV-nsp15-H238A能够跟野生型IBV一样拮抗JAK-STAT信号通路，说明在病毒感染的情况下，nsp15的核酸酶活性，对于IBV拮抗JAK-STAT通路不是必需的；由此推测，IBV还编码其他蛋白，作用于JAK-STAT信号通路，需要进一步对病毒蛋白进行筛选和研究。

IBV能够抑制JAK-STAT信号通路,降低宿主的抗病毒反应。外源表达的核酸内切酶nsp15能够进入细胞核，减少STAT1的表达，其核酸酶活性和三聚化能力均发挥关键作用；但在病毒感染的情况下，病毒编码的nsp15没有明显减少STAT1的表达，在拮抗JAK-STAT信号通路中没有起到主要作用。据此推断，IBV还编码其他蛋白，参与对JAK-STAT信号通路的拮抗。