日本血吸虫Bantam miRNA靶基因Rho相关GTP结合蛋白对雌虫卵巢发育影响的分析

李旭欣，夏天奇，李 姗，Bikash Ranjan Giri，刘静宜，李 舜，李 雪，李慧民，杜鹏飞，程国锋,

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.九江学院基础医学院，江西 332000; 3.同济大学医学院，上海 200092）

血吸虫感染引起的血吸虫病是一种影响全球超过2亿人的人类疾病，包括埃及血吸虫、曼氏血吸虫和日本血吸虫等[1]。迄今为止，还没有预防血吸虫病的有效疫苗[2]。吡喹酮作为唯一广泛应用的药物[3-4]，引起了人们对耐药性的担忧[5]。血吸虫为雌雄异体寄生虫，发育成熟的雌虫产生的大量虫卵是造成宿主病理损害和疾病再传播的根本原因。因此，深入揭示血吸虫生殖发育机理，有望开拓血吸虫病防控的新途径[1]。

miRNAs是一类小的非编码RNA（长度约22个核苷酸），在多种生物体内参与多种关键生物学进程的调控，如发育、细胞增殖和分化、细胞死亡、代谢和信号转导等[6-9]。miRNAs通常与mRNAs的3'非翻译区（UTRs）结合，对靶基因的表达进行调控，可导致蛋白质翻译抑制或mRNA降解[10]。迄今为止，在至少140个物种中已经鉴定出15 000个miRNAs，研究表明包括免疫细胞和上皮细胞等多种细胞中，高达30%的基因受miRNAs调控[11-13]。

miRNAs已在血吸虫中开展研究，被认为是血吸虫发育的重要调控因子和血吸虫病治疗的潜在靶点。我们课题组前期研究表明miRNAs在日本血吸虫不同发育时期的表达也不相同[27]。首次鉴定的日本血吸虫5个miRNAs：sja-let-7、sja-miR-71、sja-bantam、sja-miR-125和sja-miR-new1，推测它们参与了血吸虫感染、生长和发育[14]。另外，还有研究表明血吸虫表达进化保守的miRNAs（miR-8、miR-1、miR-124、miR-71和miR-195），推测它们也可能调节血吸虫发育[15]。在血吸虫病理损害中，研究表明miR-92a-2-5p、miR-454、let-7b可调控血吸虫感染诱导的肝纤维化过程，为血吸虫引起的肝纤维化提供了一种新的可能治疗靶点[16-18]。我们课题组前期研究表明外泌体的miRNA-125以及宿主的miR-148a也会调节感染血吸虫宿主外周血免疫细胞的免疫应答[19,26]。针对循环性miRNA的研究表明，miR-10、miR-3479、Bantam和miR-0001等血吸虫特异性miRNA可在感染小鼠的血浆中检测到，这些分子有望是诊断血吸虫病的一类新的生物标志物[20]。我们课题组前期研究还表明在血吸虫雌虫富集的miRNAs（miR-31和BantammiRNA等）主要存在于卵巢中，且这些miRNAs参与卵巢发育的调控[21]。BantammiRNA是在果蝇中发现的一种保守的miRNA，它最初是在对刺激组织生长的基因进行功能获得筛选时发现的[22-23]，可调节果蝇体内的促凋亡基因控制细胞增殖[24]。

为此，本研究根据生物学预测的BantammiRNA靶基因，利用荧光素酶报告基因验证该靶基因，并进一步利用RNAi研究该基因的功能。

1 材料与方法

1.1 小鼠和尾蚴清洁级昆明小鼠（8周龄）购自上海杰思捷实验动物有限公司；日本血吸虫尾蚴由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。血吸虫尾蚴经腹部皮肤贴片法感染昆明小鼠，感染后26 d时，采用灌注法收集日本血吸虫。

1.2 主要试剂一步法快速克隆试剂盒购自翌圣生物科技（上海）有限公司；AL2000 DNA marker购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；DH5α感受态细胞购自翌圣生物科技（上海）有限公司；Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自上海少辛生物科技有限公司；小干扰siRNA、阴性对照siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成；pMD19-T Vector Cloning试剂盒购自上海百赛生物技术股份有限公司；Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix购自翌圣生物科技（上海）有限公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；SMARTer RACE 5'/3'Kit购自上海百赛生物技术股份有限公司；RNAiso Plus购自上海皓嘉科技发展有限公司；lipofectamine 3000购自Invitrogen公司。293T细胞和Gaussia荧光素酶报告基因载体（pCMV-Gluc）由本实验室保存；萤火虫荧光素酶报告基因载体（pGl3）由上海兽医研究所刘光清研究员惠赠。

1.3 3' RACE技术克隆靶基因利用TRIzol提取日本血吸虫总RNA，根据转录组测序得到的BantammiRNA靶基因进行引物设计，按照SMARTer RACE 5'/3'试剂盒操作步骤，合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR反应。反应总体系（50 µL）为：3' RACE-Ready cDNA 2.5 µL，10×UPM 5 µL，3' GSP 1 µL，Master mix 41.5 µL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸3 min，共32个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，把胶回收目的片段与pMD19-T载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，然后37℃培养60 min后，菌液涂在含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，接种单个菌落于液体氨苄培养基，37℃培养6 h后进行菌落PCR将阳性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.4 3' UTR荧光素酶报告基因载体构建根据RNA hybrid预测的BantammiRNA与Rho相关GTP结合蛋白的cDNA互作区域，设计引物，PCR扩增与Rho相关GTP结合蛋白的3' UTR（F：5'-gccggtggtgactaagcggcc gcACTGGCGGTTAAGTTGGATCTT-3'；R：5'-gaca gtaagaattatttctagaTGTCCGTGTGTATTCTGTGGGCG TA-3'，酶切位点为NotⅠ、XbaⅠ），将扩增产物克隆到pCMV-Glu载体上，连接产物转化至DH5α感受态细胞。菌液PCR鉴定后进行测序验证。

1.5 荧光素酶报告基因实验将293T细胞（1×105个）200 µL/孔铺于24孔细胞培养板中，培养12 h后，利用Lipofectamine 3000将5 ng重组质粒（pCMV-Glu-3'UTR）和200 ng pGl3（对照质粒）共转染至细胞中，继续培养24 h后，将BantammiRNA mimics转染至细胞中，分为4个转染组，每组设3个重复，分别为未转染对照组、转染50 nmol/LBantammiRNA mimics、转染50 nmol/LBantammiRNA mimic和100 nmol/L anti-senseBantammiRNA；无关对照组转染50 nmol/L scrambledBantammiRNA mimics。转染24 h后，收集细胞，利用单管式化学发光检测仪根据双荧光素酶报告试剂盒说明进行荧光活性测定。

1.6 Bantam miRNA靶基因Rho相关GTP结合蛋白的干扰感染后第26 d，收集小鼠体内日本血吸虫，收集的血吸虫用PBS清洗，然后在超净台内继续用洗虫液（RPMI-1640培养基＋2% Penicillin-Streptomycin Solution）洗3遍，再用培养基（RPMI-1640培养基＋2% Penicillin-Streptomycin Solution＋10%血清）于培养箱中培养3 h。siRNA由上海吉玛公司设计并合成，共3对（表1），分别为siRNA-246，siRNA-476，siRNA-927。电转siRNA分子到血吸虫雌虫体内，条件为：电压125V，20 µs；虫体数量：10条/杯；电转杯加入70 µL RPMI1640，再加入30 µL的siRNA，siRNA终浓度为12 µmol/L，进行电转。电转结束后，虫体继续在37℃培养96 h。

表1 siRNA序列Table 1 siRNA sequences

1.7 日本血吸虫Rho相关GTP结合蛋白的siRNA的筛选收集干扰后的血吸虫虫体，提取总RNA，然后将总RNA（500 ng）反转录为cDNA。利用RT-qPCR的方法分析3对siRNA分子对Rho相关GTP结合蛋白基因的干扰效果（上游引物：5'-CGATCTAGCTATTTGGTGT-3'；下游引物：5'-GTCTGACGAGATACGAGATG-3'），利用日本血吸虫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）作为内参对照（上游引物：5'-CGAGGACCGAACAGCCAGAGAGG-3'；下游引物：5'-TCCAGACGAACTTTAGAATTC-3'）。反应体系如下：Hieff UNICON qPCR SYBR Green Master Mix 10 µL；上、下游引物各1 µL； cDNA模板1 µL； ddH2O 7 µL。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5s，56℃退火30 s，70℃延伸3 min，共40个循环。利用2–ΔΔCT计算相对表达量，利用GraphPad prism 8软件进行数据分析，用t检验进行组间的差异分析（*P<0.05表示差异不显著，不具有统计学意义；**P<0.01表示差异显著，具有统计学意义；***P<0.001表示差异极显著，具有统计学意义）。

1.8 日本血吸虫Rho相关GTP结合蛋白基因干扰后对日本血吸虫卵巢形态的影响应用干扰效果最好的siRNA分子，将siRNA电转到虫体内，电转后在37℃培养96 h。每24 h更换培养基并记录虫体活率以及培养基中的虫卵数，虫体活率根据虫体活动情况，透明度对虫体打分，有以下标准：虫体蜷缩无活动，不透明计为0分；虫体仅头部尾部运动，白色不透明计为1分；虫体活动略微僵硬，颜色半透明计为2分，虫体柔软且活跃，颜色透明计为3分。利用GraphPad prism 8软件进行数据分析，用t检验进行组间的差异分析。

培养96 h后，收集虫体，随机挑选出15条虫体进行荧光定量PCR分析。剩余的虫体进行固定，然后经30%、50%、70%的乙醇脱水，各40 min。再用盐酸卡红染液染色40 min，随后用酸酒精脱色至虫体外表面为浅红色，虫体内为深红色。再继续用80%、95%、100%的乙醇脱水，各40 min，二甲苯透明3 h，透明完成的虫体移至载玻片，用加拿大中性树脂封片，然后用激光共聚焦进行虫体卵巢形态观察。

1.9 日本血吸虫不同发育时期以及成虫不同部位Rho相关GTP结合蛋白的表达收集不同发育时期的日本血吸虫虫体（虫卵、尾蚴、7 d、14 d、21 d、28 d）并提取RNA，将总RNA（500 ng）反转录为cDNA。利用RT-qPCR的方法分析不同发育阶段Rho相关GTP结合蛋白在转录情况。同时，提取日本血吸虫雌虫不同部位的总RNA（上部、卵巢部、卵黄腺部），利用RT-qPCR的方法分析Rho相关GTP结合蛋白在日本血吸虫不同部位的转录情况，所用引物如上所述。反应体系为：Hieff UNICON qPCR SYBR Green Master Mix 10 µL；上、下游引物各1 µL； DNA模板1 µL；ddH2O 7 µL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，56℃退火30 s；70℃再延伸3 min，共40个循环。利用2–ΔΔCT计算相对表达量。

2 结果

2.1 RACE技术克隆靶基因3' UTR3' RACE PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明获得序列为1500 bp的片段（图1）。利用DNAMAN V6.0对测序结果和已知cDNA片段进行拼接和组装。同时，对编码蛋白的蛋白结构域分析（图2）。结果表明Rho相关GTP结合蛋白编码蛋白的开放阅读框长度为1017 bp，编码338个氨基酸。蛋白结构域分析Rho相关GTP结合蛋白含有GTPase结构域。

图1 3' RACE PCR产物电泳图Fig.1 Analysis of 3' RACE PCR product

图2 Rho相关GTP结合蛋白的蛋白结构域分析Fig.2 Analysis of protein domain of the Rho - associated GTP-binding protein

2.2 荧光素酶报告基因实验将构建成功的重组质粒pCMV-Glu-3' UTR，BantammiRNA mimics、anti-senseBantammiRNA或scrambledBantammiRNA mimics共转染至293T细胞中，然后进行荧光素酶的测定。结果表明共转染重组质粒pCMV-Glu-3' UTR与BantammiRNA mimics组荧光素酶的表达显著降低，进一步转染anti-senseBantammiRNA，抑制荧光素酶的表达的效果降低（P<0.05），而共转染重组质粒pCMV-Glu-3' UTR与scrambledBantammiRNA mimics组对荧光素酶的表达没有影响，提示BantammiRNA可与其互作区域互作影响蛋白表达（图3）。

图3 荧光素酶实验验证Bantam miRNA的靶基因Fig.3 Verify of the target gene of Bantam miRNA by luciferase assay

2.3 干扰血吸虫Rho相关GTP结合蛋白基因的最佳siRNA的筛选根据Rho相关GTP结合蛋白的cDNA序列，设计并合成3对siRNA分子（siRNA-246、siRNA-476、siRNA-927）。电转siRNA分子到体外培养的虫体，RT-qPCR分析获得最佳siRNA分子。实验结果显示siRNA-476干扰使日本血吸虫Rho相关GTP结合蛋白（TNN14903.1）在转录水平表达量最低（P<0.05)，干扰效果最好（图4）。

图4 RT-qPCR检测不同的siRNA分子对Rho相关GTP结合蛋白的干扰效果Fig.4 Screening of the best siRNAs for inhibiting a Rho related GTP binding protein by RT-qPCR

2.4 干扰日本血吸虫Rho相关GTP结合蛋白对卵巢的影响将干扰Rho相关GTP结合蛋白最好的siRNA-476电转入血吸虫体内，经过短期培养，观察并记录干扰组和对照组的虫体活力和卵巢发育情况。结果表明干扰后虫体的活性显著降低，同时干扰Rho相关GTP结合蛋白也可导致体外培养的虫体产卵量显著降低（图5～6）。利用激光共聚焦显微镜对虫体卵巢进行观察，结果表明siRNA-476抑制虫体后导致血吸虫卵巢出现明显的裂纹状空泡，而对照组未有观察到类似变化（图7）。

图5 显微镜下虫体活力的统计分析Fig.5 Statistical analysis of worm viability

图6 干扰前后雌虫产卵量的变化Fig.6 Changes in egg laying capacity of female worms after siRNA treatment

图7 激光共聚焦观察干扰前后虫体卵巢的变化Fig.7 Morphological alternations of ovary structures of worms treated with NC siRNA and siRNA-476 by confocal microscope

2.5 日本血吸虫不同发育阶段以及不同部位Bantam miRNA靶基因的表达分析利用RT-qPCR技术分析BantammiRNA靶基因Rho相关GTP结合蛋白在日本血吸虫中不同时期以及虫体不同部位的表达水平。结果表明该蛋白在日本血吸虫各个时期均有表达，其中28 d血吸虫表达量显著高于21 d、14 d和7 d（图8），且在卵巢部分表达最高（图9）。

图8 RT-qPCR分析Rho相关GTP结合蛋白在日本血吸虫不同发育阶段的表达Fig.8 Expression profile of the Rho related GTP binding protein at different developmental of S.japonicum

图9 RT-qPCR分析Rho相关GTP结合蛋白在虫体不同部位的表达Fig.9 Expression of the Rho related GTP binding protein in three different dissected parts of female S.japonicum

3 讨论

血吸虫病是主要流行在热带和亚热带地区的一种人兽共患寄生虫病，危害严重，目前仍然没有有效疫苗，血吸虫病的防控和治疗严重依赖于化学药物——吡喹酮[3]，获得有效的疫苗候选分子可能是防控血吸虫的突破之一。

研究表明果蝇体内BantammiRNA是Hippo信号通路下游的一个重要分子靶标，Hippo通路通过调节BantammiRNA表达来调控细胞的生理作用，包括细胞的增殖凋亡与死亡，进而调节器官的体积和大小[25]。考虑到该通路在不同物种中的保守性，推测BantammiRNA在日本血吸虫体内也发挥重要调控作用。小的Rho-GTPases是众所周知的许多基本细胞过程的调节因子，包括细胞骨架动力学、细胞极性、粘附和迁移，从而控制各种上皮组织的形态发生。Rho、Cdc42和Rac1是Rho GTPase家族中被研究最多的成员，最近被证明可以控制胰腺形态发生的不同方面，包括分支过程的启动，小管形成和胰岛细胞迁移[28]。Rho-GTPases是控制真核细胞内多种信号转导途径的分子开关。它们主要以调节肌动蛋白细胞骨架的关键作用而闻名，同样参与细胞极性、微管动力学、膜转运途径和转录因子活性调控。这种生物复杂性的调控可通过开启一个GTPase，几个不同的信号通路可以被协同激活[29]。

本研究是在课题组完成的日本血吸虫小RNA转录组测序的基础上完成的，利用生物信息学分析获得BantammiRNA的靶基因Rho相关GTP结合蛋白，开展后续研究。首先，将与BantammiRNA互补的序列克隆至pCMV-Glu载体上，利用双荧光素酶报告基因的实验验证了BantammiRNA与Rho相关GTP结合蛋白基因序列互作。课题组前期研究表明BantammiRNA在日本血吸虫中表达具有期别和性别差异性，其中在雌虫体内高表达，尤其在配子生成器和成熟产卵期。本实验证明BantammiRNA的靶基因Rho相关GTP结合蛋白在日本血吸虫在成熟产卵期高表达，并且在卵巢部位高表达，这表明Rho相关GTP结合蛋白与BantammiRNA互动调控可能在卵巢发育过程中可能扮演着重要角色。

进一步研究设计针对靶基因Rho相关GTP结合蛋白的siRNA，通过电转的方式将siRNA转到雌虫体内，发现与电转siRNA组虫体卵巢内出现一系列裂纹状的空泡，且产卵量显著降低。综上研究提示BantammiRNA靶基因Rho相关GTP结合蛋白调控卵巢结构以及雌虫产卵方面发挥重要作用，具体调控机制值得深入研究。