那他霉素光降解杂质的制备与结构鉴定

董 月,于 兰#,李晓露,曹鹏然,林 旸,赵建强

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢技术创新中心,河北 石家庄 052165;2.华北制药华胜有限公司,河北 石家庄 052160)

那他霉素(Natamycin),又称匹马霉素(Pimamycin),是一种首次从链霉菌中提取得到的四烯类抗生素。那他霉素最早被用作食品添加剂,用于抑制食品中酵母、霉菌的生长。体外活性研究显示,那他霉素具有抗多种丝状真菌和酵母的活性,与利福平或庆大霉素联用对镰刀菌具有协同抑制作用[1-4]。那他霉素的抗真菌活性与剂量具有一定相关性,杀菌机制为:其与真菌细胞膜上的固醇相结合转化为多烯固醇复合物,通过改变细胞膜内外渗透压使细胞内容物外溢,造成真菌细胞死亡[5]。1978年,那他霉素眼用制剂在美国批准上市,用于治疗真菌性角膜炎,疗效显著[6-8]。目前,那他霉素已被广泛应用于抗真菌治疗、食品绿色防腐及农业真菌性病害治理等领域,具有巨大的社会价值。

那他霉素经微生物发酵、提炼和精制制得,为白色或淡黄色结晶粉末。那他霉素原料药在存放过程中杂质含量不断增加,且该杂质对光敏感。随着药品质量标准的不断提高,药品杂质特别是潜在杂质控制越来越受到重视。鉴于此,作者将那他霉素精品进行光降解,得到那他霉素光降解杂质粗品,采用制备液相色谱法对那他霉素光降解杂质粗品进行分离纯化,并通过MS和NMR等分析手段对其结构进行鉴定,为那他霉素的质量控制及安全储运提供技术参考。

1 实验

1.1 试剂与仪器

那他霉素精品(批号YFNT220301,纯度99.1%),华北制药集团新药研究开发有限责任公司;乙腈、甲醇、氘代二甲基亚砜(DMSO-d6),色谱纯,美国Merck公司;乙腈、甲醇,制备级,安徽时联特种溶剂股份有限公司;其它试剂均为分析纯。

分析液相色谱系统,Agilent公司;制备液相色谱系统,北京澳诺科技有限公司;光照试验仪,Star iTech公司;TDL-40B型台式离心机,上海安亭科学仪器厂;旋转蒸发器,Heidolph公司;分析天平,Mettler-Toledo公司;质谱仪(Acquity UPLC系统,PDA检测器),Waters公司;AVANCE Ⅲ 500型核磁共振波谱仪,Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 那他霉素精品的光降解

取10 g那他霉素精品于表面皿中摊成薄层,置于光照试验仪中进行光降解实验,调整光照强度为5 000 Lx,每隔一定时间取样检测,当目标杂质比例达到一定要求后,停止光照,得到那他霉素光降解杂质粗品。

1.2.2 那他霉素光降解杂质粗品的分离纯化

将那他霉素光降解杂质粗品用甲醇溶解,参照《中华人民共和国药典2020年版 二部》[9]中那他霉素有关物质检测条件进行HPLC在线分析,收集目标杂质纯度大于95%的洗脱液,浓缩至干,得到那他霉素光降解杂质纯品。

1.2.3 检测条件

制备色谱条件:Kromasil 100-10-C18制备色谱柱(21.2 mm×250 mm),洗脱剂为乙腈-2%乙酸铵缓冲液(30∶70,体积比,下同),检测波长为303 nm。

质谱条件:样品用甲醇溶解,电喷雾电离源(ESI),正离子检测。

核磁共振波谱条件:样品用DMSO-d6溶解。

2 结果与讨论

2.1 光照时间对那他霉素光降解的影响

按1.2.1方法在光照强度5 000 Lx下进行光降解实验,分别在5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d取样检测,那他霉素目标杂质比例分别为0、0.11%、0.24%、1.13%、1.80%、2.37%。结果表明,在强光照射下,那他霉素易降解生成目标杂质,且随着光照时间的延长目标杂质比例逐渐增大,同时有其它杂质生成。

2.2 纯化条件优化

洗脱剂对那他霉素光降解杂质粗品纯化效果的影响见表1。

表1 洗脱剂对那他霉素光降解杂质粗品纯化效果的影响

由表1可知,以乙腈-1%醋酸水溶液(40∶60)为洗脱剂时,目标杂质与那他霉素不能有效分离;以乙腈-1%醋酸水溶液(30∶70)为洗脱剂时,分离效果略好,但出峰时间较长,且峰型较宽、拖尾严重;以乙腈-1%乙酸铵缓冲液(30∶70)为洗脱剂时,峰型较好,但不能实现良好分离;以乙腈-2%乙酸铵缓冲液(30∶70)为洗脱剂时,分离效果明显改善,目标杂质HPLC纯度达到95%以上。因此,选择乙腈-2%乙酸铵缓冲液(30∶70)作为洗脱剂进行分离纯化,得到那他霉素光降解杂质纯品16 mg。

那他霉素光降解杂质粗品和纯品的HPLC图谱见图1。

2.3 杂质结构鉴定

2.3.1 MS分析(图2)

图2 那他霉素光降解杂质的MS图谱Fig.2 MS spectrum of photodegradation impurity of Natamycin

2.3.2 NMR分析

那他霉素光降解杂质的13CNMR和1HNMR数据见表2。

表2 那他霉素光降解杂质的13CNMR和1HNMR数据

2.3.3 结构解析

由MS(ESI+)图谱可知,该光降解杂质的相对分子质量为665,与那他霉素的相对分子质量相同。参照文献[5]对NMR数据进行分析,发现该光降解杂质与那他霉素的C、H个数相同,因此,确定该光降解杂质的分子式与那他霉素相同。比对该光降解杂质与那他霉素的NMR数据,可以看出二者数据基本一致,其中C12 (ΔδC2.8)、C15(ΔδC2.6)、C27(ΔδC1.6)等的化学位移差别较大,推测是由C15和C12构型的改变引起;在NOESY图谱中可观察到H12/H14和H12/H10的NOE效应,表明H12为β朝向;NOESY图谱中H15与H12无NOE相关,表明H15为α朝向,即C15处构型未发生改变。

综上,推测该光降解杂质为那他霉素的C12位差向异构体,其结构式见图3。

图3 那他霉素光降解杂质的结构式Fig.3 Structure formula of photodegradation impurity of Natamycin

3 结论

将那他霉素精品在光照强度5 000 Lx下进行光降解,得到那他霉素光降解杂质粗品,采用制备液相色谱法对那他霉素光降解杂质粗品进行分离纯化,并通过MS和NMR 等分析手段对其结构进行鉴定,确定该光降解杂质为那他霉素的C12位差向异构体。该研究开发了一种微量潜在杂质的制备方法,对于开展药品质量控制和安全性评价具有重要意义。