HPLC法测定新疆沙枣花中椴树苷与紫云英苷的含量

郭敬宇,巴依尔太,熊远果,万超超,孙 芸*

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学图书馆,新疆 乌鲁木齐 830011;3.武汉大学人民医院药学部,湖北 武汉 430060)

沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)为胡颓子科胡颓子属植物,是西北地区防风固沙天然屏障之一。沙枣花气味芳香浓郁,有“飘香沙漠的桂花”之称[1]。《维吾尔药志》中记载,沙枣花名为吉格德且其克,具有芳香补脑、平喘宽胸、防病除疫等功效,常用于治疗哮喘、胸痛、关节炎等症[2]。《沙漠地区药用植物》中记载,沙枣花味甘、涩,性温,可止咳平喘[3]。

沙枣花中的挥发性香气成分主要为酯类、醛类、醇类等[4-8],具有抗氧化、抗炎等作用[9-11]。椴树苷和紫云英苷是沙枣花中含量较多的黄酮类成分,目前关于其抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等药理作用的研究较多[12-17],而关于其单成分定量方面的研究较少。鉴于此,作者采用HPLC法同时测定新疆不同产地沙枣花中椴树苷、紫云英苷的含量,分析产地与各成分含量的相关性,拟为新疆沙枣花的质量控制提供科学依据。

1 实验

1.1 材料

沙枣花,采集于新疆喀什地区伽师县米夏乡(SZH-1,2022-04-28)、新疆五家渠市(SZH-2,2022-05-15)、新疆塔城地区额敏县169团(SZH-3,2022-05-25)、新疆克拉玛依市东湖公园(SZH-4,2022-05-22)、新疆第七师130团(SZH-5,2022-05-21)、新疆哈密市陶家宫镇(SZH-6,2022-05-11)、新疆哈密市伊州区(SZH-7,2022-05-21)、新疆奎屯市东晖苑社区(SZH-8,2022-05-09)、新疆奎屯市高泉镇124团(SZH-9,2022-05-15)、新疆乌鲁木齐市儿童公园(SZH-10,2022-05-14)、新疆乌鲁木齐市鲤鱼山公园(SZH-11,2022-05-22)、新疆乌鲁木齐市南湖公园(SZH-12,2022-05-24)、新疆乌鲁木齐市植物园(SZH-13,2022-05-25)、新疆乌鲁木齐市西山民族乡(SZH-14,2022-05-20)、新疆乌鲁木齐市西山104团(SZH-15,2022-05-20)、新疆乌鲁木齐市小绿谷公园(SZH-16,2022-05-25)等地,经新疆医科大学中医医院田红林主任药师鉴定为胡颓子科胡颓子属植物沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)的花。

1.2 试剂与仪器

椴树苷对照品(质量分数≥98%,批号wkq21062504),四川维克奇生物科技有限公司;紫云英苷对照品(质量分数≥98%,批号7346),上海诗丹德标准技术服务有限公司;乙腈、磷酸、乙酸,色谱纯;其余试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。

Agilent 1200型高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;AB135-S型分析天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;KQ5200DE型超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;艾柯超纯水仪,成都艾柯环保设备有限公司。

1.3 溶液的制备

对照溶液的制备:精密称取椴树苷对照品、紫云英苷对照品适量,加甲醇溶解,制成质量浓度分别为0.406 0 mg·mL-1、0.105 0 mg·mL-1的对照溶液,过0.22 μm微孔滤膜,备用。

供试溶液的制备:称取沙枣花粉末约1 g,按料液比1∶20(g∶mL)加入70%乙醇,置于具塞锥形瓶中,精密称重;超声(200 W,40 kHz)处理30 min,再次称重,补足重量,取上清液,过0.22 μm微孔滤膜,即得供试溶液,备用。

1.4 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温30 ℃。流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱程序:0～15 min,10%～23%A;15～20 min,23%～35%A;20～25 min,35%～40%A;25～30 min,40%A。流速1.0 mL·min-1;检测波长360 nm;进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件分析

取混合对照溶液、供试溶液,按1.4色谱条件进样分析,结果见图1。

图1 混合对照溶液(a)及供试溶液(b)的HPLC图谱Fig.1 HPLC spectra of mixed control solution(a) and test solution(b)

由图1可知,供试溶液中椴树苷和紫云英苷有明显的吸收峰,且分离度较好,均大于1.5,表明该色谱条件适用于沙枣花中椴树苷、紫云英苷的含量测定。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察

将椴树苷对照溶液、紫云英苷对照溶液等比例稀释成不同浓度,按1.4色谱条件进样分析。以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,拟合得线性回归方程:椴树苷:y=4.4216x+1.8657,R2=0.9999;紫云英苷:y=6.4081x+0.9861,R2=0.9998。椴树苷、紫云英苷浓度分别在12.687 5～406.00 μg·mL-1、3.281 3～105.00 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.2 精密度考察

取混合对照溶液,按1.4色谱条件连续进样6次,计算得到椴树苷、紫云英苷峰面积的RSD值分别为0.42%、0.38%,表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性考察

取沙枣花粉末6份,按1.3方法制备供试溶液,按1.4色谱条件进样分析,计算得到椴树苷、紫云英苷峰面积的RSD值分别为1.28%、1.35%,表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性考察

取沙枣花供试溶液,按1.4色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样分析,计算得到椴树苷、紫云英苷峰面积的RSD值分别为0.32%、1.00%,表明供试溶液在24 h内稳定。

2.2.5 加标回收率考察

精密吸取已知椴树苷、紫云英苷含量的供试溶液9份各1 mL,按低、中、高水平加入已知含量的对照溶液,按1.4色谱条件进样分析,结果见表1。

表1 加标回收率结果(n=9)

2.3 实际样品测定

取16批沙枣花药材,按1.3方法制备供试溶液,按1.4色谱条件进样分析,计算椴树苷、紫云英苷的含量,结果见表2。

表2 椴树苷、紫云英苷含量测定结果(n=3)/(mg·g-1)

2.4 聚类分析

将16批沙枣花样品中椴树苷、紫云英苷含量测定结果导入IBM SPSS Statistics 21软件中,采用系统聚类、组间联接、平方欧氏距离等方法进行聚类分析,结果见图2。

图2 16批样品聚类分析树状图Fig.2 Cluster analysis dendrogram of 16 batches of samples

由图2可知,当间距为10时,16批样品分为3类:SZH-8、SZH-15为一类,SZH-16为一类,SZH-1～SZH-7、SZH-9～SZH-14为一类。

2.5 讨论

采用DAD检测器在200～800 nm范围内分别对椴树苷、紫云英苷进行全光谱扫描。结果显示,椴树苷在320 nm处有最大吸收,紫云英苷在360 nm处有最大吸收。通过比较2种检测波长下,供试溶液中椴树苷、紫云英苷的响应值,最终选定检测波长为360 nm。

参照相关文献,选取乙腈-磷酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液等流动相体系进行比较,最终选定乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,发现HPLC图谱基线平稳,目标组分与干扰组分能够良好分离。

通常植物的有效成分或活性成分主要是次生代谢产物,次生代谢产物的积累受生态、环境等因素的影响[18]。以16批沙枣花为样本的聚类分析结果表明,16批沙枣花中椴树苷和紫云英苷含量差异较大,椴树苷含量均高于紫云英苷含量,其中新疆奎屯市东晖苑社区、新疆乌鲁木齐市植物园、新疆乌鲁木齐市西山104团、新疆乌鲁木齐市小绿谷公园等4批沙枣花的椴树苷、紫云英苷含量均较高,可能是土壤环境、采摘时间不同导致。

3 结论

建立了同时测定新疆不同产地沙枣花中椴树苷、紫云英苷含量的HPLC法,测得16批沙枣花样品中椴树苷、紫云英苷含量分别为2.395 7～4.714 0 mg·g-1、0.070 7～0.166 4 mg·g-1。16批沙枣花聚类分析结果表明,椴树苷、紫云英苷的含量与产地关系不大,没有地域接近、含量接近的现象。本研究为沙枣树的合理种植、沙枣花产品的开发及质量控制提供了一定的依据。