母B族链球菌定植致新生儿巨噬细胞相关细胞因子及免疫功能改变的研究

袁莹莹 刘海燕 郭 芳（广州医科大学附属第二医院新生儿科，广州 510260）

B 族链球菌（colonization of group B streptococcus，GBS）感染作为一类于女性的消化道下端和生殖道正常定植的革兰氏阳性球菌，又被称为无乳链球菌［1］。在新生儿娩出的过程中，吸入或吞进GBS可引发严重的脑膜炎、肺炎、败血症，导致其发生神经系统相关的后遗症，甚至死亡，也是当前国际公认可以诱发新生儿出现侵袭性感染的第一因素［2］。相关研究数据指出，有10%～30%孕妇中存在GBS感染，40%～70%的新生儿可能会感染GBS［3］。新生儿出现的GBS 感染主要有早发、晚发型两种，早发疾病引起的新生儿病死率为11.1%，晚发疾病引起的新生儿病死率为27.8%［4］。T 淋巴细胞是机体免疫反应细胞，亦是人体中重要的调节免疫的细胞，能够调节机体免疫功能，在机体正常情况下，体内CD4+/CD8+T 维持动态平衡，以保证机体免疫功能正常［5］。巨噬细胞属于人体内的免疫细胞，巨噬细胞的主要功能为吞噬侵入体内的病原体、死亡细胞及死亡细胞释放的内容物，并作为抗原提呈细胞激活T 细胞，机体对侵入的病原体做出免疫应答反应［6］。当新生儿感染GBS后，体内的T淋巴细胞对蛋白质、多肽抗原产生免疫应答，巨噬细胞因子能够激活机体相关的免疫细胞，对抗GBS，进而引起体内细胞免疫功能改变［7］。既往对新生儿感染GBS的相关因素报道研究较多，但GBS 致新生儿巨噬细胞相关细胞因子及免疫功能改变的研究仍较少见。因此，本研究着重探讨GBS 致新生儿巨噬细胞相关细胞因子及免疫功能改变的情况，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 取2020 年3 月至2022 年1 月广州医科大学附属第二医院收治的确诊母GBS 定植的新生儿43例，设为研究组，纳入标准：①依据美国2010 版CDC《围产期GBS 预防指南》，对孕34～37 周妇女门诊行GBS PCR 快速筛查，如阳性，则进一步培养宫颈分泌物，培养阳性纳入标准；如培养阴性，但母合并胎膜早破>18 h，或体温超过38 ℃，或患绒毛膜羊膜炎，考虑存在宫内感染可能，也纳入本研究；②患儿家属自愿参与；③进行GBS PCR 快速筛查前后均未进行抗生素治疗。排除标准：①早产引起的呼吸窘迫；②合并心脏疾病；③合并肿瘤；④患有院内感染；⑤合并其他类型感染；⑥拒绝参加。同期广州医科大学附属第二医院健康新生儿40 例为对照组。其中，研究组年龄0～10 d，病程3～10 d，体质量2 305～3 368 g；对照组年龄0～5 d，体质量2 380～3 472 g。两组患儿的性别等一般资料差异无统计学意义（P>0.05），见表1。所有患儿的监护人均知晓此次试验的方案且签署知情同意书，该方案经过广州医科大学附属第二医院临床研究与应用伦理委员会批准（2019-ks-KY-04）。

表1 两组患者一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between 2 groups

1.1.2 试剂与仪器 双标记单克隆抗体CD3+/CD19+和CD4+/CD8+及红细胞溶解均购自法国国际免疫公司。流式细胞仪（型号：MAX15036，贝克曼库尔特公司）；双标记单克隆抗体CD3+/CD19+和CD4+/CD8+试剂盒由美国的R&D 公司提供；相关趋化因子水平血清巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）、CXCL9、CXCL10、CCL3的试剂盒由美国的R&D公司提供。

1.2 方法

1.2.1 干预方法 孕期女性GBS 的确诊手段：无菌聚酯纤维拭子（均为一次性使用）采集孕妇（孕周超过34 周）肛周和阴道的分泌物给予鉴定培养（选择性GBS 培养平板培养）并将其他常见阴道病原菌排除（如支原体、衣原体等混合感染）。

研究组和对照组的新生儿出生时采集脐动脉血，检测T淋巴细胞亚群水平、NK 细胞水平、趋化因子以及巨噬细胞相关的细胞因子浓度水平。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 检测T 淋巴细胞亚群水平、NK 细胞水平 新生儿出生时采集脐动脉血2 ml，EDTA 抗凝处理后，2 000 r/min 离心5 min，分离细胞后，使用流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群水平（CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、CD3+CD4+T）以及NK 细胞水平。两支试管中各加入100 µl EDTA 抗凝静脉血，再分别加入20 pt 的双标单克隆抗体CD3+/CD19+T 和CD4+/CD8+T，室温避光孵育20 min后，加 500 µl 红细胞溶解液溶解红细胞15 min，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用PBS 缓冲液冲洗2 次，再以0.5 ml PBS 缓冲液悬浮细胞，流式细胞仪分析5 000 个细胞，严格按照相关的说明书步骤操作，批内和批间差异在10%、15%以内。

1.2.2.2 血清巨噬细胞相关细胞因子、相关趋化因子水平检测 新生儿出生时采集脐动脉血2 ml，EDTA抗凝处理后，2 000 r/min 离心5 min，-80 ℃冰箱保存。采用Bio-plex 的悬液芯片多重检测技术检测血清巨噬细胞相关细胞因子血清中IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平；检测相关趋化因子水平MIF、CX-CL9、CXCL10、CCL3。严格依照相关试剂盒的说明书步骤操作，将批内和批间差异10%、15%以内。

1.2.2.3 母GBS 定植的新生儿临床表现 统计GBS 血流感染患儿临床表现。临床表现有发热、气促、反应差、血压低、花斑纹、黄疸、抽搐等。

1.3 统计学方法 本研究数据采用SPSS26.0软件分析，以［n（%）］代表计数资料，用χ2检验比较，组间两两对比用卡方分割法，以代表正态分布的计量资料，组间比较采用独立样本t检验比较，正态分布资料的相关性采用Person 相关性分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的T淋巴细胞亚群水平及NK细胞水平变化比较 研究组CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 细胞水平均高于对照组，CD3+CD4+T低于对照组（P<0.05）。此结果说明母GBS定植对其T 淋巴细胞亚群水平及NK 细胞水平具有一定影响，见表2。

表2 T淋巴细胞亚群水平及NK细胞水平变化比较（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

表2 T淋巴细胞亚群水平及NK细胞水平变化比较（）Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets and NK cell levels（）

2.2 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平 两组IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平进行对比，研究组患儿IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平均高于对照组（P<0.05）。母GBS 定植新生儿的IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10 水平明显较高，见表3。

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比较（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

表3 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平比较（，pg/ml）Tab.3 Comparison of IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10 levels（，pg/ml）

2.3 巨噬细胞相关趋化因子水平 两组巨噬细胞相关趋化因子对比，研究组患儿MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于对照组（P<0.05）。此结果亦说明母GBS 定植新生儿与健康新生儿进行对比，MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平呈现异常升高的趋势，见表4。

表4 巨噬细胞相关趋化因子比较（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

表4 巨噬细胞相关趋化因子比较（，pg/ml）Tab.4 Comparison of macrophage-related chemokines（，pg/ml）

2.4 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相关趋化因子、细胞免疫功能与新生儿GBS感染相关性分析 Person 相关性分析显示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 细胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 与新生儿GBS 感染呈正相关，CD3+CD4+T 水平与新生儿GBS 感染呈负相关（P<0.05）。见表5。

表5 IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、相关趋化因子、细胞免疫功能与新生儿GBS感染的相关性分析Tab.5 IFN-γ，IL-13，IL-4，IL-10，related chemokines，cellular immune function and neonatal GBS infection

2.5 母GBS 定植的新生儿临床表现 对母GBS 定植新生儿的临床表现进行追踪，发现43例新生儿出现呼吸窘迫4例，休克1例，败血症2例，脑膜炎1例，胃液培养阳性2 例。在经过临床对症治疗后，研究组均治愈出院。

3 讨论

GBS自从1938年被首次报告，直至1970年才被认为是新生儿败血症、脑膜炎以及肺炎的主要致病菌［9］。欧美国家GBS 比较常见，是诱发新生儿出现严重的感染菌群之一，亦被列为细菌感染新生儿的第一位致病菌［10］。GBS 感染具有患病率高、病死率高、致残率高的特点，临床表现多为肺炎、呼吸衰竭、高热等。早发型GBS 感染以肺炎、肺动脉高压和菌血症为主要的特征，随着疾病的不断发展，新生儿败血症后期可发生心肌功能障碍血压下降、弥散性血管内凝血、周围中性粒细胞减少等［11-12］。国外报道指出，近20年来，美国、英国等欧美国家出现GBS 感染最高的人群即是新生儿，其具体的发生率61%、28%，病死率超过2成［13-14］。近年来，随着我国生育政策的调整，我国每年新生儿人数不断增多，新生儿GBS 感染发病率也不断上升。新生儿GBS感染的主要途径则是母婴感染，大部分是新生儿分娩期间接触了母体产道存在的细菌或者是羊膜早破诱发的各种上行感染［15］。

胚胎期T 淋巴细胞的来源大多是肝和卵黄囊，正常人体的T 淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，在新生儿时期，骨髓里面少量的多能干细胞向着胸腺内迁移，之后在胸腺激素的刺激下分化、成熟，转变为具有一定免疫活性的T细胞［16］。巨噬细胞主要由单核细胞分化产生，是一类定制在组织内部的白细胞，其能够分泌很多类型的酶及各种活性因子，包括血小板的衍生物生长因子、白细胞介素、多肽转换的生长因子以及肿瘤坏死因子等［17］。机体发生炎症反应时，体内的巨噬细胞主要用于机体损失位置组织、病原体的清除等，促进机体的创伤愈合。本次研究中，研究组CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 细胞水平均高于对照组，CD3+CD4+T低于对照组。分析认为：新生儿GBS 感染后，促进了体内炎症反应，而T 淋巴细胞作为免疫活性T细胞，在清除体内病原体的同时，刺激大量CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T 产生，进一步导致感染GBS的新生儿体内T淋巴细胞水平异常。研究组患儿IFN-γ、MIF、IL-4、IL-10、IL-13、CXCL9、CXCL10、CCL3 水平均高于对照组。对于感染GBS 的新生儿，其体内成熟的T 细胞可以通过血流移动到外周免疫的各个器官，经过多个组织进行再循环，发挥免疫调节以及细胞免疫作用，同时T 细胞的再循环则可加强免疫应答，对抗GBS［18］。GBS 进入生殖道向上到宫内，导致新生儿感染GBS，而上皮细胞是抵御病原菌的第一道防线，巨噬细胞可以吞噬并消灭外部的病原菌，刺激机体各种细胞因子不断地释放，在新生儿的身体中，巨噬细胞接触IFN-γ 后，产生炎症因子，激活巨噬细胞杀死病原菌的能力并提高其抗原具体的提呈能力，促进炎症细胞因子IL-10、IL-4、IL-13 分泌，杀灭入侵的病原体，从而抑制体内的炎症反应［19］。三磷酸甘油醛脱氢酶位于GBS 表面，可以诱导巨噬细胞实施吞噬行为，促进IL-4、IL-10 因子的分泌，在GBS 血流感染患儿体内发挥抗炎作用。

结合本研究结果，Person相关性分析显示，血清CD3+T、CD19+T、CD3+CD8+T、CD4+/CD8+T、NK 细胞水平、IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10、MIF、CXCL9、CXCL10、CCL3 与新生儿GBS 感染呈正相关，CD3+CD4+水平与新生儿GBS 感染呈负相关（P<0.05）。侧面证实了新生儿GBS 感染与巨噬细胞相关细胞因子、T 淋巴细胞亚群水平存在显著相关性，对于在产前确诊母GBS 定植的新生儿，可以尽早检测巨噬细胞相关细胞因子、T 淋巴细胞亚群水平，从而为临床上治疗、评估新生儿GBS 感染提供诊断依据。新生儿出现4例呼吸窘迫，休克1例，败血症2例，脑膜炎1例，胃液培养阳性2例。研究组均治愈出院。

研究结果证实，对于新生儿GBS 感染患儿尽早采取针对性的干预措施，能有效地改善患儿预后，降低患儿发生呼吸窘迫、休克、脑炎等并发症的风险。

综上所述，巨噬细胞相关细胞因子及T 淋巴细胞亚群水平参与了新生儿GBS 感染的免疫应答过程，巨噬细胞相关细胞因子及细胞免疫功能改变与新生儿GBS 感染相关。孕晚期母GBS PCR 筛查有利于识别早发型GBS 感染。受样本量限制，本研究结果有待扩大化的中心试验证实。