早期ART对HIV急性期感染者双阴性T细胞频率和表型的影响①

李 珍 王 蕊 陆小凡 粟 斌 张 欣 张 彤 吴 昊 黄晓婕

（首都医科大学附属北京佑安医院，感染性疾病临床研究中心，艾滋病研究北京市重点实验室，北京 100069）

双阴性（double-negative，DN）T 细胞是一种独特的T 细胞亚群，仅占外周血总T 细胞的1%～3%，其表面表达TCRαβ 或TCRγδ，但不表达CD4 和CD8［1］。越来越多的研究认为，DN T 细胞在调节固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用。

研究发现，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）感染、CD4+T 细胞减少的白眉猴中，DN T 细胞可补偿辅助T 细胞的功能，维持正常的免疫功能［2-3］。而在HIV急性感染者中，DN T细胞的比例与疾病进展相关，并可预测免疫活化的调定点［4-5］。早期ART 有效抑制HIV 复制，降低T 细胞免疫活化，促进CD4+T细胞数量恢复。然而，早期ART后HIV 感染者DN T 细胞数量和表型的变化尚不清楚。DN T 细胞是多克隆的细胞群，70%以上为γδ T细胞［6-7］。外周血γδ T细胞主要分为Vδ1和Vδ2 T细胞两个亚群，参与抗HIV 感染免疫应答及疾病进展［8-9］。因此，本研究将DN T 细胞分为Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 细胞三个亚群，阐明早期ART 后HIV 感染者DN T细胞各亚群数量和表型的变化。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 入组HIV 急性期感染者39 例，来源于北京佑安医院HIV 急性期感染者临床研究队列［8］。入组标准：①男男性行为接触者人群（MSM）；②HIV 急性期感染：HIV-1 抗体阴性或抗体不确定，HIV RNA 阳性［10］；③接受早期ART，并完成96 周随访。排除标准：合并乙肝、丙肝或结核感染者和合并机会性感染者。年龄和性别相匹配的HIV阴性者为健康对照组（n=21）。所有参与者均签署知情同意书，本研究已通过首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会的审批（批准编号：2020-147；2021-371）。

1.1.2 流式抗体 PE 标记的抗人Vδ2TCR mAb（IMMU389，Beckman Coulter 公司，美国）；FITC 标记的抗人Vδ1TCR mAb（TS8.2，Pierce 公司，美国）；APC 标记的抗人HLA-DR mAb（L243）、Percp-cy5.5标记的抗人CD38 mAb（HIT2）、PE-cy7 标记的抗人CD3 mAb（UCHT1）、APC-cy7 标记的抗人CD8 mAb（SK1）、BV421 标记的抗人CD4 mAb（RPA-T4）和对应的同型抗体（Biolegend公司，美国）。

1.1.3 其他材料 RPMI1640 培养基（Hyclone 公司，美国）；牛血清白蛋白（中国医学科学院生物医学工程研究所，中国）；1×PBS（pH=7.2～7.4）（Gibco公司，美国）；FACS Calibur TruCount计数管和Canto Ⅱ流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 T 淋巴细胞绝对计数 采用FACS Calibur TruCount 计数管和多色标记抗体（CD3/CD4/CD8/CD45）标记细胞，流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+T细胞的百分比和绝对数。

1.2.2 病毒载量检测 血浆病毒载量采用雅培Real-time HIV-1 M2000 系统进行检测，最低检测限为40拷贝/ml。

1.2.3 流式细胞术 取分离的PBMCs，流式洗液（PBS+1%BSA）洗涤后，1 500 r/min 离心5 min；荧光抗体标记细胞，同时设定单阳对照和同型对照管，室温避光孵育20 min。洗涤细胞后，加入300 µl 2%多聚甲醛固定液。流式细胞仪采集数据，FlowJo（V10.8）分析数据（图1）。

图1 流式细胞数据分析流程图Fig.1 Flow chart diagram of flow cytometry data analysis

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0 和GraphPad Prism 9.3 统计分析数据和作图。数据以表示。计量资料比较采用独立样本t检验，两组间各参数的比较采用Mann-WhitneyU检验，ART 治疗前后各参数的比较采用配对t检验，Spearman 秩和相关法分析变量之间的相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料分析 HIV 急性期感染者平均感染时间为（58.40±18.50）d，年龄与健康对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。ART 96 周后，CD4+T 细胞数量较基线显著增加（P<0.000 1，表1）。

表1 健康对照组和HIV急性期感染者的基础资料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

表1 健康对照组和HIV急性期感染者的基础资料（）Tab.1 Basic characteristics of HCs and AHIs（）

Note：Comparison of CD4+T cell counts at baseline and 96 weeks after ART，1）P<0.000 1.NA.Not applied；HCs.Healthy controls；AHIs.Acute HIV-infected individuals.

2.2 DN T细胞数量的比较 HIV急性感染者DN T细胞的比例显著低于健康对照组。ART 96 周后HIV 感染者DN T 细胞的比例较基线时增加，但仍低于健康对照组（图2A）。此外，HIV 感染者DN T 细胞的比例与基线CD4+T细胞计数和病毒载量无相关性，而与ART 96 周后CD4+T 细胞的数量呈显著正相关（图2B～D）。

图2 健康对照组、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T细胞数量的比较Fig.2 Comparisons of frequencies of DN T cells among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.3 早期ART 对HIV 感染者DN T 细胞亚群比例的影响 与健康对照组相比较，HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后，Vδ1 T 细胞的比例均显著升高，Vδ2 T 细胞的比例显著降低，而三组间Vδ1/2negT 细胞的比例差异无统计学意义（P>0.05，图3A～C）。相关性分析结果显示，ART 96周后感染者CD4+T细胞的数量与Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞的比例无相关性，而与Vδ1/2negT细胞的比例呈负相关趋势（图3D～E）。

图3 早期ART对HIV感染者DN T细胞亚群比例的影响Fig.3 Effects of early ART on frequencies of DN T cell subsets in AHIs

2.4 DN T 细胞亚群活化水平的比较 HIV 急性期感染者Vδ1、Vδ2 和Vδ1/2negT 细胞的活化水平均显著高于健康对照组。早期ART 96周后Vδ1和Vδ2 T细胞的活化水平降低，与健康对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。然而，ART 96 周后Vδ1/2negT细胞的活化水平仍显著高于健康对照组（图4）。

图4 健康对照组、HIV 急性期感染者0 周和ART 96 周后DN T细胞亚群活化水平的比较Fig.4 Comparison of activation of DN T cell subsets among HCs，AHIs at 0 week and 96 weeks after ART

2.5 HIV 感染者DN T 细胞亚群活化与病毒载量和CD4+T 细胞计数的相关性 如图5 所示，Vδ2 T 细胞的活化与病毒载量呈正相关，Vδ1 和Vδ1/2negT 细胞的活化与病毒载量无相关性（图5A～C）。基线（0周）时，Vδ1和Vδ2 T细胞的活化与CD4+T细胞计数呈显著负相关，而Vδ1/2negT 细胞的活化与CD4+T 细胞计数无相关性（图5D～F）。ART 96 周后，Vδ1/2negT 细胞的活化与CD4+T 细胞计数呈负相关趋势，而Vδ1 和Vδ2 T 细胞的活化CD4+T 细胞计数无相关性（图5G～I）。

图5 DN T 细胞亚群活化与病毒载量和CD4+T 细胞数量的相关性Fig.5 Correlations between activation of DN T cell subsets and plasma viral load or CD4+T cell counts

3 讨论

DN T细胞兼有辅助T细胞和调节性T细胞的功能，在炎症、免疫性疾病和癌症中起重要作用［7］。而DN T 细胞在HIV 急性期感染中的研究相对较少。本研究发现HIV 急性感染者DN T 细胞的比例显著降低，尽管早期ART 使DN T 细胞的数量增加，但仍低于健康对照组。ART 后，DN T 细胞的比例与CD4+T 细胞计数呈正相关。该结果表明，即使在HIV 感染急性期开始启动ART，DN T 细胞的数量仍不能完全恢复，进而影响CD4+T细胞的恢复，引起免疫重建不良。免疫重建不良者DN T 细胞的比例低于免疫重建良好者［11］。

DN T细胞是一种多克隆细胞群，但目前尚无特定的表型来进行亚群分类［6-7］。由于DN T 细胞大部分是γδ T 细胞，本研究将DN T 细胞分为Vδ1、Vδ2和Vδ1/2negT 细胞三个细胞亚群，发现HIV 急性期感染者Vδ1 T细胞的比例显著增加，Vδ2 T细胞的比例显著降低。早期ART 不能降低Vδ1 T 细胞的比例，也不能使Vδ2 T 细胞的比例完全恢复。Vδ1 T 细胞是IL-17分泌的主要来源，HIV 感染者疾病快速进展IL-17+γδ T 细胞比例的增加，与免疫活化显著相关［9，12］。因此，Vδ1 T 细胞数量的增加可能与免疫活化及炎症的持续存在有关。此外，HIV 感染者Vδ1/2negT 细胞的比例与健康对照组无显著差异，并与ART 96 周后CD4+T 细胞的数量呈负相关趋势，提示Vδ1/2negT细胞可能抑制CD4+T细胞的增殖。

免疫活化是HIV 感染的主要特征，也是影响ART 后HIV 感染者免疫重建的主要因素之一［13］。与既往研究结果一致［9，14］，本研究发现HIV 急性期感染者Vδ1 和Vδ2 T 细胞的活化水平显著升高，与疾病进展密切相关。早期ART使Vδ1和Vδ2 T细胞的活化水平正常化，但ART后Vδ1/2negT细胞的活化水平仍高于健康对照组，与CD4+T 细胞计数呈负相关趋势。该结果提示，ART 后Vδ1/2negT 细胞持续活化可能与CD4+T 细胞恢复不良有关。有研究报道，免疫重建不良者TGF-β+DN T 细胞的比例低于免疫重建良好者［11］。TGF-β 是一种抗炎因子，ART 后HIV 感染者TGF-β 分泌持续减少，而促炎因子IFN-γ、TNF-α 等分泌增加，使Vδ1/2negT 细胞持续活化［15-16］。

此外，ART 后Vδ1/2negT 细胞持续高水平活化，可能与低水平HIV复制有关。TCRα/β+DN T细胞和γδ T 细胞中可检测到HIV DNA，静止的CD4-T 细胞中存在少量HIV gag 蛋白表达［17-19］。而CHENEY等［20］认为，DN T 细胞中HIV DNA 的存在，是ART 后病毒学抑制失败引起的，并不是真正有效的病毒库。本研究尚未检测HIV 感染者DN T 细胞亚群中HIV-DNA 的含量及其功能，需在今后的研究中完善。