SERPINE1在胃癌中的免疫浸润和ceRNA网络的综合分析①

时 谨 代德柱 宋旭东 郭霞梅 封紫玉 陶国全

（南京医科大学附属淮安第一医院胃肠外科，淮安 223300）

胃癌是第五大常见癌症之一，同时也是全球第二大癌症相关死亡原因，流行性及危害性巨大［1-2］。胃作为一种囊状器官，早期肿瘤不易导致管腔阻塞引起症状，因此大部分患者确诊时已处于晚期［3］。目前胃癌主要治疗方法包括手术、放化疗和靶向治疗等。化学疗法和靶向治疗在改善晚期胃癌患者预后方面作用有限，急需新的治疗手段［4-5］。探索胃癌患者预后相关生物标志物对改善晚期胃癌患者预后至关重要［6］。

纤溶酶原激活物抑制剂1 型（plasminogen activator inhibitor type 1，SERPINE1）是丝氨酸蛋白酶的重要抑制剂，在信号转导、细胞黏附和细胞迁移中发挥重要作用［7-8］。已有研究表明SERPINE1在多种癌症中异常表达，促进癌症发生发展［9-10］。但SERPINE1在胃癌中的作用鲜有报道。

本研究首先对SERPINE1 在多种类型人类癌症中进行了表达分析和生存分析，运用多维分析评价目标基因在胃癌中的表达及相关基因和功能网络，探讨其表达差异与肿瘤免疫的联系，为发现可能存在的分子调控网络提供理论依据，在胃癌队列中进行了基因共表达分析、免疫细胞浸润和免疫检查点相关性分析，探索了SERPINE1 的非编码RNA 网络（ncRNA 相关调控网络，包括miRNA 及lncRNA），最终确定了SERPINE1 表达与免疫细胞浸润、免疫细胞生物标志物或胃癌免疫检查点的相关性，结果表明ncRNA 介导的SERPINE1 上调与STAD 患者不良预后及肿瘤免疫浸润相关。

1 资料与方法

1.1 SERPINE1 表达谱数据提取 分析来自癌症基因组图谱（TCGA）的正常组织数据与泛癌（BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD、THCA 和UCEC）数据，研究各类型癌症和正常组织间的SERPINE1 表达失调。在UCSC Xena 网站（https：//xena.ucsc.edu/）下载STAD（胃癌）的癌症相关RNA 序列、临床病理特征及生存数据。比较来自GTEx 数据库（http：//commonfund.nih.gov/GTEx/）的正常组织样本以及来自TCGA 的肿瘤样本中SERPINE1的差异表达［11］。

1.2 GEPIA 数据库分析SERPINE1 在胃癌中的表达 GEPIA 数据库中，以SERPINE1 为目标基因，癌症类型选择STAD（胃癌），匹配TCGA 正常组织表达数据进行可视化分析［12］。

1.3 Kaplan Meier-Plotter生存分析 采用R 软件包分析胃癌患者SERPINE1 高/低表达组与生存预后的相关性，使用Kaplan-Meier 曲线对胃癌中的 SERPINE1 表达与患者总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）、无病期（DFS）和无进展期（PFS）的相关性进行绘图分析，并使用单变量生存分析计算风险比（HR）及95%置信区间。

1.4 免疫浸润分析 TIMER 数据库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）用于分析STAD（胃癌）中SERPINE1 表达与免疫细胞浸润和免疫检查点的相关性。此外，使用R 语言基于TCGA 的ggplot2 包评估SERPINE1表达与胃癌免疫检查点的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。使用ssGSEA 方法分析24 种免疫细胞在肿瘤中的浸润情况。采用Spearman 相关法分析SERPINE1 与上述24 种免疫细胞的相关程度及SERPINE1 高/低表达组免疫细胞浸润情况［13］。

1.5 胃癌中SERPINE1 共表达分析和通路富集分析 使用R 语言的ClusterProfiler 包分析SERPINE1的GO 功能和KEGG 通路富集。使用ggplot2 软件包可视化分析数据。

1.6 SERPINE1 蛋白互作网络构建 STRINGS（www.string-db.org）是一个在线分析网站，包含所有公开可用的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）数据［14］。使用STRING 对SERPINE1进行PPI网络分析。

1.7 miRNA 预测利用starBase2.0（www.starbase.sysu.edu.cn）在线网站预测SERPINE1 的目标miRNA，通过PITA、miRanda 和TargetScan 对结果进行分析［15］。进一步分析靶miRNA 表达与SERPINE1表达的相关性，筛选出更符合ceRNA条件的miRNA。使用TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert）在线工具预测目标miRNA 和SERPINE1 的潜在结合位点。

1.8 lncRNA 和ceRNA 网络构建预测 通过上述方法筛选出has-miR-19a-3p、has-miR-148a-3p和hasmiR-19b-3p，使用miRNet1.0（www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）、miRNet2.0（www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）和starBase 对上述3 种miRNA 进行靶lncRNA 预测［16］。进一步分析靶miRNA 表达与lncRNA 表达的相关性，筛选出更符合ceRNA 条件的lncRNA。综合分析“miRNA-mRNA”和“miRNAlncRNA”，建立胃癌关键“lncRNA-miRNA-mRNA”的ceRNA网络。

1.9 蛋白印迹实验 取2021 年6 月至2022 年9 月南京医科大学附属淮安第一医院（伦理批号：KY-2022-090-01）的胃癌组织和癌旁标本各3份，细胞裂解缓冲液裂解组织，提取总蛋白，10%SDS-PAGE 凝胶分离30 µg总蛋白，转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，按照一抗说明书将PVDF 膜分别置入抗SERPINE1抗体（Abcam 公司产品，ab222754，1∶1 000稀释）及抗GAPDH 抗体（GTX100118，1∶5 000 稀释），4 ℃过夜。洗膜，置入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（Abcam 公司产品，ab7090，1∶10 000 稀释）稀释液室温孵育1 h，化学发光底物显影。

1.10 统计学处理 所有统计分析均在R语言中进行。采用ROC曲线分析SERPINE1可否作为诊断标志物。采用T检验分析临床病理特征与SERPINE1表达的关系。由于TCGA 数据库中临床信息并不完整，患者年龄、TNM 分期等临床信息部分缺失，无法完成完整分析，且部分结果中的样本总数与不同临床类别样本数也存在差异。

2 结果

2.1 SERPINE1 在泛癌中的表达 为确定肿瘤和正常组织中SERPINE1表达差异，通过TCGA数据库分析目标基因在21 种人类癌症中的表达（图1），与相应正常组织相比，SERPINE1 在12 种癌症类型中表达差异有统计学意义，9 种高表达，包括乳腺浸润性癌（BRCA）、结肠腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）、直肠腺癌（READ）、胃癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）；低表达的为肾嫌色细胞（KICH）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肝细胞癌（LIHC）；在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、胆管癌（CHOL）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞癌（LUSC）、胰腺癌（PAAD）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、前列腺癌（PRAD）、子宫内膜癌（UCEC）中差异无统计学意义。

图1 SERPINE1在21种人类肿瘤中的表达Fig.1 SERPINE1 expression in 21 types of human cancer

2.2 胃癌患者SERPINE1 表达 为评估胃癌和正常组织中SERPINE1 表达，使用R 语言软件分析从TCGA 数据库获得的RNA 测序数据，FPKM（Fregments Per Kilobase per Million）格式的RNAseq 数据转换为TPM（transcripts per million reads）格式并进行log2转化，得到mRNA表达的TCGA谱（包括375个胃癌和32 个正常组织样本）。由于TCGA 数据库胃癌的癌旁组织样本较少（图2A），从GTEx 数据库下载359 个正常样本（图2B），发现与正常组织相比，SERPINE1 在胃癌组织中过表达（P<0.001）。通过GEPIA 数据库进一步验证胃癌组织中SERPINE1 呈高表达（图2C）。基于TCGA 数据集分析27 个胃癌组织及其相邻正常胃组织提示SERPINE1 在胃癌中的表达较高（P<0.001，图2D）。ROC 曲线分析SERPINE1 的诊断价值，AUC 为0.871（图2E），具有一定诊断价值。Western blot 验证3 对临床组织样本，结果表明胃癌中SERPINE1 表达显著高于相邻正常组织（图2F）。表明SERPINE1可能是胃癌的一种潜在诊断生物标志物。

2.3 SERPINE1 表达与临床病理特征的关系 为更好地了解SERPINE1在胃癌中的作用，使用TCGA队列分析其与某些临床特征的关联。独立样本T检验显示，T2&T3&T4 高于T1 平均水平，White 高于Asian 平均水平，Tumor 高于Normal 平均水平，G3 高于G2 平均水平（P<0.05）。癌症晚期患者SERPINE1 表达较高。提示SERPINE1 高表达与较晚的T 分期（P<0.001，图3A）、种族（P=0.003，图3B）、临床状况（P<0.001，图3C）和较低级别的组织病理分级（P=0.009，图3D）相关。表明SERPINE1 表达与临床特征有关。

2.4 SERPINE1 表达与患者预后相关 通过OS、DFS、DSS 和PFS 分析进一步验证SERPINE1 表达与胃癌预后的相关性，K-M结果显示，SERPINE1高表达患者OS较短（P=0.000 030 2，图4A）。SERPINE1高表达胃癌患者DFS、DSS 及PFS 均较差（P=0.033 6、0.011 6、0.004 0，图4B～D）。提示SERPINE1 高表达与患者不良预后相关。

图4 SERPINE1 mRNA水平在STAD患者中的预后价值Fig.4 Prognostic value of SERPINE1 mRNA level in STAD patients

2.5 SERPINE1 与胃癌组织免疫细胞浸润相关肿瘤微环境中的免疫浸润在肿瘤预后中起关键作用，肿瘤免疫治疗作为一种创新治疗方式也逐渐被人们熟知［17］。通过TIMER 数据库评估SERPINE1与胃癌组织免疫细胞浸润的相关性（图5A），SERPINE1与胃癌免疫细胞浸润水平显著相关（P<0.05）。独立免疫细胞浸润相关性分析可为研究SERPINE1 功能和机制提供关键线索。进一步评估SERPINE1 表达与各种免疫细胞浸润的相关性（图5B），SERPINE1 表达与大部分免疫细胞呈正相关，包括胃癌组织中的CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞（P<0.05），与B 细胞则呈负相关（P<0.05）。根据SERPINE1表达将375个肿瘤样本分为两组，其中高表达组188 个样本，低表达组187 个样本，分析24个免疫细胞在不同SERPINE1表达组的差异表达以确定胃癌中 SERPINE1高表达和低表达的肿瘤免疫微环境是否存在差异（图5C），结果表明，SERPINE1高/低表达组CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK 细胞、效应记忆型T细胞表达差异大、相关性强。表明胃癌组织中SERPINE1 表达以不同方式参与免疫细胞浸润。

图5 STAD组织免疫浸润与SERPINE1表达的关系Fig.5 Relationship between immune infiltration and expression of SERPINE1 in STAD

2.6 胃癌中SERPINE1 表达与免疫检查点的联系 PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 是肿瘤免疫逃逸的重要免疫检查点。考虑到SERPINE1 在胃癌中的潜在致 癌作 用，评估SERPINE1 与PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 的关系（图6A、C、E），SERPINE1 表达与胃癌中PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 表达呈正相关（纯度调整）。通过GEPIA 数据库再次对SERPINE1 与胃癌中PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 的相关性进行分析，结果与TIMER 数据分析一致（图6B、D、F）。表明肿瘤免疫逃逸可能参与SERPINE1介导的胃癌进展。

图6 STAD 中SERPINE1表达与PDCD1、TIGIT、HAVCR2表达的关系Fig.6 Relationship between SERPINE1 expression and PDCD1，TIGIT and HAVCR2 expressions in STAD

2.7 与SERPINE1 共表达基因的功能富集分析为探索SERPINE1 在胃癌中的生物学功能，进行SERPINE1 共表达分析。绘制胃癌中基于SERPINE1 共表达状态的差异表达火山图［|log2Fold-Change（log2FC）|≥1，图7A］以及胃癌中与SERPINE1正/负相关的热图（共27个基因，图7B），共表达阈值为P<0.05。针对共表达基因进行GO 和KEGG 分析。气泡图显示前12 条关于GO 和KEGG 的信息，包括BP（生物学过程）、CC（细胞成分）、MF（分子功能）和KEGG。GO 功能注释显示SERPINE1 共表达主要参与胰腺分泌。KEGG 通路分析显示SERPINE1 共表达主要与表皮生长、表皮细胞分化和角质形成细胞分化通路有关（图7C）。

图7 SERPINE1在STAD中的功能富集分析Fig.7 Functional enrichment analysis of SERPINE1 in STAD

2.8 通路富集分析 为进一步阐明SERPINE1在胃癌发生发展中的潜在机制，使用STRING数据库构建SERPINE1的PPI网络。前10个功能伴侣基因（LRP1、PLAUR、PLAT、PLAU、VTN、PLG、VLDLR、SMAD2、SMAD3和SMAD7）具有高度连接性（图8A、B），通过R 语言clusterProfiler 包对SERPINE1 及相关基因进行GO 和KEGG 富集分析（P<0.05，图8C）。BP 主要包括“伤口愈合负调节”“对伤害反应的调节”和“伤害反应的负性调节”。CC 主要包括膜的外在成分、血小板α 颗粒管腔和网格蛋白涂层坑。MF 主要包括转化生长因子受体、胞质介质活性、载脂蛋白结合和转化生长因子受体结合。KEGG 主要包括补体和凝血级联、组织Apelin 信号通路和Hippo 信号通路。具体分析上述伴侣基因与SERPINE1 表达在胃癌患者中的关系，发现目标基因与PLAT 水平呈正相关（r=0.476，P<0.001，图8D）。同时PLAT 高表达也与胃癌较差的预后相关（P<0.001，图8E）。

图8 信号通路功能标注与预测Fig.8 Functional annotation and prediction of signaling pathways

2.9 胃癌中SERPINE1 相关miRNA 越来越多的证据表明“lncRNA-miRNA-mRNA” ceRNA 网络在多种人类癌症中发挥关键作用，因此本研究利用在线工具分析和构建胃癌中涉及SERPINE1的ceRNA 网络。使用PITA、miRmap 和miRanda 数据库分别分析和预测142、45 和38 个SERPINE1 目标miRNAs。Venn 图显示了预测结果，被3 个数据库共同预测的靶miRNA 共21 个，包括hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsamiR-130a-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-150-5p、hsamiR-193a-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-301b-3p（图9A）。分析靶miRNA 表达与SERPINE1表达的相关性以筛选更符合ceRNA 条件的miRNA（图9B），相关性分析证明有3个靶miRNA表达与SERPINE1呈负相关，即hsamiR-19a-3p（r=-0.187，P<0.001）、hsa-miR-148a-3p（r=-0.202，P<0.001）和hsa-miR-19b-3p（r=-0.145，P<0.001）。TargetScan 预测SERPINE1 与靶miRNA存在潜在结合位点（图9C）。

图9 胃癌中SERPINE1靶向miRNAs预测Fig.9 Prediction of miRNAs targeting SERPINE1 in gastric cancer

2.10 胃癌中SERPINE1相关ceRNA 网络构建 使用miRNet、starBase 和starBase2.0 在线数据库进一步预测可能与3 种靶miRNA（hsa-miR-19a-3p、hsamiR-148a-3p 和hsa-miR-19b-3p）结合的lncRNA（图10A～C）。基于ceRNA 网络假设，lncRNA 与miRNA 呈负相关。因此使用starBase 数据库分析胃癌中靶lncRNA 表达与miRNA 的相关性（图10D），有5 个靶lncRNAs 表达与hsa-miR-148a-3p 呈负相关，分别为H19、HOTAIRM1、KIF9-AS1、NUTM2AAS1 和OIP5-AS1。仅有FGD5-AS1 和SLC26A4-AS1表达与hsa-miR-19a-3p 呈负相关（图10E），FGD5-AS1 和SLC26A4-AS1 表达与hsa-miR-19b-3p 呈负相关（图10F）。基于ceRNA假设，miRNA与lncRNA或mRNA 呈负相关，因此基于相关性分析结果可构建9 对ceRNA 网络（H19-miR-148a-3p-SERPINE1、HOTAIRM1-miR-148a-3p-SERPINE1、KIF9-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、NUTM2A-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、OIP5-AS1-miR-148a-3p-SERPINE1、FGD5-AS1-miR-19a-3p-SERPINE1、SLC26A4-AS1-miR-19a-3p-SERPINE1、FGD5-AS1-miR-19b-3p-SERPINE1 和FGD5-AS1-miR-19b-3p-SERPINE1，图10G）。

图10 lncRNA和ceRNA网络在胃癌中的构建预测Fig.10 Prediction of lncRNA and ceRNA network construction in gastric cancer

3 讨论

胃癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，作为公共卫生危机持续存在［18-19］。SERPINE1 是一种从肝细胞组成型释放的蛋白酶抑制剂，可作为细胞迁移的调节剂，参与细胞黏附和扩散调节，从而参与肿瘤发生发展过程［20］。研究表明SERPINE1 在多种癌症中过表达，尤其是胃癌，其高表达预示较差的总生存期［21］。本研究通过生物信息学分析和实验验证了SERPINE1在胃癌中的差异表达。

通过TCGA 数据分析发现SERPINE1 在9 种癌症中高表达。通过对TCGA 胃癌队列分析发现，与正常组织相比，胃癌组织中SERPINE1 表达明显升高，与GEPIA 数据库分析结果一致。SERPINE1 表达与T分期、种族、肿瘤状态、组织学分级显著相关。SERPINE1 高表达提示更晚的癌症阶段和较差预后。

为探索胃癌中SERPINE1 与免疫浸润的关系，使用TIMER数据库揭示胃癌中SERPINE1表达与免疫浸润水平的关系，发现SERPINE1 表达与大部分免疫细胞包括CD8+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈显著正相关，但与B细胞呈负相关。另外，在24 种免疫细胞中还发现SERPINE1 高/低表达组间CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK 细胞、效应记忆型T细胞表达差异较大，且有统计学意义［22］。近年免疫检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗方面取得了突破性成果［23］。在抑制性免疫检查点分子中，PDCD1、TIGIT 和HAVCR2 抗体阻断在癌症免疫治疗中的功效正在广泛研究中［24-25］。本研究发现SERPINE1与胃癌中的PDCD1、TIGIT和HAVCR2 表达呈显著正相关，表明肿瘤免疫逃逸可能参与SERPINE1 介导的胃癌发生发展过程。因此认为SERPINE1在胃癌免疫调节中起重要作用。

ceRNA间的串扰通过lncRNA或环状RNA（circ-RNA）竞争性结合miRNA 影响mRNA 表达实现［26］。lncRNA 和circRNA 起miRNA 海绵 作用，降 低体 内miRNA丰度，从而干扰miRNA对下游靶基因的抑制作用［27-28］。本研究首先预测了SERPINE1 的一些上游miRNA，PITA、miRmap 和miRanda 数据库共同预测了21 个潜在的上游miRNA，进一步筛选仅有3 个miRNA（hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-19b-3p）表达与胃癌SERPINE1 显著负相关。LI等［29］报道胃癌中miR-19a-3p 过表达可促进肿瘤进展。BAO 等［30］发现miR-148-3p 在胃癌中低表达，上调miR-148a-3p 可抑制胃癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞样特性。WEI 等［31］报道miR-19b-3p 在胃癌中低表达，可通过负调控Neuropilin-1 抑制胃癌发展。lncRNA 可直接与miRNA 结合发挥阻碍miRNA的作用，促进mRNA 表达。进一步预测了这些关键miRNA 的上游lncRNA，通过相关性分析，9 个lnc-RNA（H19、HOTAIRM1、KIF9-AS1、NUTM2A-AS1、OIP5-AS1、FGD5-AS1、SLC26A4-AS1、FGD5-AS1、SLC26A4-AS1）被定义为关键lncRNA，进一步提示分析的可行性。SERPINE1 的ceRNA 网络是通过生物信息学分析得到的，还需更多实验证实。

综上，本研究全面分析了胃癌中SERPINE1 表达与肿瘤免疫浸润和ceRNA 网络的关系，通过多种生物信息学分析提取并分析了来自TCGA、GTEx、GEPIA、TIMER 等的数据集，研究SERPINE1 参与胃癌的潜在致癌机制，包括SERPINE1 与诊断、预后、免疫检查点、肿瘤微环境、免疫细胞浸润及其可能的作用机制。进一步GO 和KEGG 研究SERPINE1在胃癌中的潜在作用，发现与正常组织相比，胃癌组织中SERPINE1 mRNA 水平较高，SERPINE1 表达在中低分化胃癌组织中较高。此外，发现SERPINE1 可能是胃癌的独立预后因素，且SERPINE1高表达与胃癌不良预后相关。SERPINE1 表达与多种免疫细胞相关，可能通过抑制免疫细胞浸润影响胃癌发生发展。SERPINE1 也被证实与免疫相关基因及免疫检查点共表达。SERPINE1 可能通过胰腺分泌、表皮生长、表皮细胞分化和角质形成细胞分化通路调节胃癌发病机制；PPI 分析结果提示SERPINE1可能通过PLAT参与胃癌进展。SERPINE1的ceRNA 网络构建表明SERPINE1 可能参与胃癌多种分子调控机制。SERPINE1 可作为胃癌诊断和治疗的有效生物标志物，且是免疫治疗的潜在靶点。