荞麦黄酮通过下调HMGB1抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤的研究

袁小波 彭小珊 周丽丽 唐 静（湘潭市第一人民医院医学转化中心，湘潭 411100）

糖尿病视网膜病变是糖尿病的常见并发症，也是导致成年人失明的主要原因之一［1］。目前，糖尿病视网膜病变的发病机制尚不明确，研究认为，持续的高血糖造成的人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）损伤是其发生发展的关键，因此，抑制高糖引起的HRMECs损伤对于糖尿病视网膜病变的治疗尤为重要［2］。荞麦黄酮是荞麦的主要活性成分，具有降血糖、降脂、抗炎等功效［3］。有报道称，荞麦黄酮可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症因子表达和纤维化，其作用机制与下调细胞中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）远端缺失同源盒6反义RNA1（distal-less homeobox 6 antisense RNA1，DLX6-AS1）表达有关［4］。然而，荞麦黄酮能否影响HRMECs 损伤还未知。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种炎症因子，除参与调控炎症反应外，还对细胞凋亡、氧化损伤等具有调控作用［5］。研究显示，HMGB1 在糖尿病大鼠视网膜组织及高糖诱导的HRMECs 中均表达升高，敲减HMGB1 可通过抑制半胱天冬酶-3（caspase-3）活化及促进B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表达，减少高糖诱导的HRMECs 凋亡［6-7］。本研究建立高糖诱导的HRMECs 损伤模型，旨在观察荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 损伤的影响及其能否通过调控HMGB1 发挥作用，以期为其用于糖尿病视网膜病变的治疗提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HRMECs（上海信裕生物科技有限公司，批号：220518）；DMEM 培养液、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（北京索莱宝，批号：2022061211、2022270509、2022051627、2022041408）；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）实验试剂盒、胎牛血清（浙江天杭，批号：220425、220503）；蛋白质印迹实验所需抗体（中国Abcam 公司，批号：20220408）；引物序列、HMGB1过表达载体（pcDNA-HMGB1）和空载体（pcDNA）（上海生工，批号：20220517、20220515、20220426）；LipofectamineTM2000试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：2022051611）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-10 试剂盒（南京建成，批 号：220415、220520、220504、220328、220501、220408）。

1.2 方法

1.2.1 制备荞麦黄酮 参照文献［3］方法制备荞麦黄酮：将购买并经鉴定的荞麦花叶进行干燥，以1∶7（质量∶体积）添加50%乙醇，60 ℃回流2 h，提取3 次，合并滤液。将滤液用AB-8 打孔吸附树脂分离，用水洗柱子，用50%乙醇解吸被吸附的提取物即为荞麦黄酮。

1.2.2 细胞培养和转染 复苏HRMECs，用完全培养液（含10 %胎牛血清的DMEM 培养液）置于CO2培养箱中培养。于6 孔板中接种2.5 ml HRMECs（5.0×104个/ml），培养24 h 后，利用LipofectamineTM2000 试剂盒分别转染pcDNA、pcDNA-HMGB1，转染时间为12 h，将转染后的细胞用于后续实验。

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖活性 ①于96 孔板中接种0.2 ml HRMECs（5.0×104个/ml），培养4 h 后，分别用含0、0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml 荞麦黄酮的培养液培养24 h。②于96 孔板中接种0.2 ml HRMECs（5.0×104个/ml），培养4 h后，分为正常对照（NC）组、HG 组、HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组，NC 组细胞用常规培养液培养24 h，HG 组细胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培养液培养24 h［7］，HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组细胞分别用0.5、1.0、2.0 mg/ml 荞麦黄酮和30 mmol/L葡萄糖的培养液共同培养24 h［4］。③于96孔板中接种0.2 ml 转染pcDNA、pcDNA-HMGB1 的HRMECs（5.0×104个/ml），均按照HG+高荞麦黄酮组进行处理，并分别记为HG+荞麦黄酮+pcDNA 组和HG+荞麦黄酮+pcDNA-HMGB1 组。各组细胞培养结束后，向每孔中加10 µl CCK-8，孵育细胞2 h，置于酶标仪卡槽中，设置波长450 nm，检测各孔光密度（OD）值。细胞抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组）×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 于6 孔板中接种2.5 ml HRMECs 或转染pcDNA、pcDNA-HMGB1的HRMECs，培养4 h 后，按照上述1.2.3 中②和③分别分组培养。各组细胞培养结束后，PBS 清洗细胞。加500 µl结合缓冲液重悬细胞，加10 µl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，再加5 µl PI，避光孵育5 min后，利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.2.5 比色法检测MDA、LDH 和SOD 细胞接种和培养同1.2.4。各组细胞培养结束后，将细胞用PBS 清洗后，加裂解液裂解，3 500 r/min 离心10 min后，取上清液，分别利用MDA、SOD 试剂盒检测上清液中MDA含量、SOD 活性。将各组细胞培养上清液3 500 r/min离心10 min，取上清液，利用LDH 试剂盒检测LDH漏出量。

1.2.6 ELISA 检测TNF-α、IL-6和IL-10 细胞接种和培养同1.2.4。各组细胞培养结束后，收集细胞培养上清液，3 500 r/min 离心10 min。取上清液，分别采用TNF-α、IL-6 和IL-10 ELISA 试剂盒检测其水平。

1.2.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达 细胞接种和培养同1.2.4。各组细胞培养结束后，将细胞用PBS清洗。用RIPA 试剂获取细胞中总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。用SDS-PAGE 实验分离总蛋白，并转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h。于4 ℃冰箱中分别用B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、HMGB1（1∶1 000）和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1 000）一抗孵育过夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）于37 ℃孵育1 h。加显影液显影，曝光拍照，Image J软件分析Bax、Bcl-2 和HMGB1 相 对GAPDH 的 表达量。

1.2.8 RT-PCR 检测HMGB1 mRNA 表达 细胞接种和培养同1.2.4。各组细胞培养结束后，采用RNA 提取试剂盒提取各组细胞中总RNA，逆转录为cDNA 后，进行扩增。引物序列：HMGB1正向5´-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3´，反 向5´-GCTGCATCAGGCTTTCCTTT-3´；GAPDH 正 向5´-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3´，反 向5´-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3´。2-ΔΔCt法计 算HMGB1 mRNA 相对GAPDH的表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计分析。各检测指标均符合正态分布，以xˉ±s 表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较先用单因素方差进行分析，使用LSD-t检验进行组间两两比较。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荞麦黄酮对HRMECs活性的影响 与0 mg/ml荞麦黄酮组比较，不同剂量（0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml）荞麦黄酮组HRMECs 抑制率无显著变化，说明此剂量范围内的荞麦黄酮对HRMECs活性无显著影响。见图1。

图1 荞麦黄酮对HRMECs抑制率的影响Fig.1 Effect of buckwheat flavone on inhibition rate of HRMECs

2.2 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 凋亡的影响 与NG 组比较，HG 组HRMECs 抑制率、凋亡率、细胞中Bax 蛋白表达升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表达降低（P<0.05）。与HG 组比较，HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组HRMECs抑制率、凋亡率、细胞中Bax 蛋白表达降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表达升高（P<0.05），且HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组各检测指标比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2、表1。

表1 荞麦黄酮对HRMECs凋亡的影响（，n=3）Tab.1 Effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

图2 荞麦黄酮对HG 诱导的HRMECs 凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.2 Effects of buckwheat flavone on HG-induced HRMECs apoptosis and expressions of Bax and Bcl-2 protein

2.3 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 氧化应激的影响 与NG 组比较，HG 组HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05）。与HG 组比较，HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组HRMECs 中MDA含量、LDH 漏出量降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05），且HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组各检测指标比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 氧化应激的影响（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

表2 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 氧化应激的影响（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.4 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 炎症因子表达的影响 与NG 组比较，HG 组IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.05）。与HG 组比较，HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组IL-6 和TNF-α 水平降低（P<0.05），IL-10 水平升高（P<0.05），且HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组各检测指标比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs炎症因子表达的影响（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

表3 荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs炎症因子表达的影响（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.5 荞麦黄酮对高糖诱导的视网膜微血管内皮HRMECs 细胞中HMGB1 表达的影响 与NG 组比较，HG 组HMGB1 mRNA 和蛋白表达水平升高（P<0.05）。与HG 组比较，HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组HMGB1 mRNA 和蛋白表达水平降低（P<0.05），且HG+低荞麦黄酮组、HG+中荞麦黄酮组和HG+高荞麦黄酮组各检测指标比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3、表4。

表4 荞麦黄酮对HG 诱导的HRMECs 中HMGB1 表达的影响（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

表4 荞麦黄酮对HG 诱导的HRMECs 中HMGB1 表达的影响（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

图3 荞麦黄酮对HG 诱导的HRMECs 中HMGB1 蛋白表达的影响Fig.3 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 protein in HG-induced HRMECs

2.6 过表达HMGB1 逆转荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 凋亡的影响 HG+荞麦黄酮+pcDNAHMGB1组HRMECs中HMGB1 mRNA和蛋白表达量均高于HG+荞麦黄酮+pcDNA组（P<0.05）。与HG+荞麦黄酮+pcDNA 组比较，HG+荞麦黄酮+pcDNAHMGB1 组HRMECs 抑制率、凋亡率、Bax 蛋白表达均升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表达降低（P<0.05）。见图4、表5。

表5 过表达HMGB1逆转荞麦黄酮对HRMECs凋亡的影响（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

表5 过表达HMGB1逆转荞麦黄酮对HRMECs凋亡的影响（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

图4 过表达HMGB1 逆转荞麦黄酮对HRMECs 凋亡及HMGB1、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.4 Overexpression of HMGB1 reversed effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis and protein expressions of HMGB1，Bax，Bcl-2

2.7 过表达HMGB1 逆转荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 氧化应激和炎症因子表达的影响 与HG+荞麦黄酮+pcDNA 组比较，HG+荞麦黄酮+pc-DNA-HMGB1 组HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05），IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10 水平降低（P<0.05）。见表6。

表6 过表达HMGB1逆转荞麦黄酮对HG诱导的HRMECs氧化应激和炎症因子表达的影响（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

表6 过表达HMGB1逆转荞麦黄酮对HG诱导的HRMECs氧化应激和炎症因子表达的影响（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

3 讨论

近年来，由于居民饮食结构的改变，糖尿病发病率呈增长趋势［8］。作为糖尿病的并发症之一，糖尿病视网膜病变的发病率也随之升高［9］。糖尿病患者长期处于高血糖状态，高血糖可诱发HRMECs 产生过度的氧化应激、炎症反应甚至凋亡，这也是糖尿病视网膜病变发生发展的重要原因。因此，抑制高糖诱导的HRMECs 损伤对糖尿病视网膜病变的治疗尤为重要。本研究发现，不同浓度的荞麦黄酮对HRMECs 活性无显著影响，将适量浓度的荞麦黄酮作用于高糖诱导的HRMECs，结果显示，荞麦黄酮能够呈剂量依赖性地增强高糖诱导的HRMECs 活性，并减少细胞凋亡，提示其对HRMECs 发挥保护作用。Bax 是一种促凋亡分子，其表达增加时促进细胞凋亡；Bcl-2 则发挥抗凋亡作用，其表达增加对细胞凋亡起抑制作用［10］。本实验数据显示，荞麦黄酮抑制了高糖诱导的HRMECs 中Bax 蛋白表达，促进了Bcl-2蛋白表达，说明其发挥抗高糖诱导的HRMECs凋亡与调控Bax/Bcl-2有关。

持续的高血糖可诱导HRMECs 氧自由基生成增加，自由基进一步与细胞膜脂质、细胞内蛋白质及核酸发生一系列氧化反应，造成细胞氧化损伤［11］。MDA 是脂质过氧化产物，其水平高低可间接反映细胞氧化应激水平［12］。SOD 是机体内重要的抗氧化酶，可清除自由基，减轻自由基对机体组织的氧化损伤［13］。在细胞受损时，细胞膜通透性发生改变，LDH 被释放。因此，细胞培养上清液中LDH漏出量越高，说明细胞受损越严重［14］。本实验数据显示，荞麦黄酮降低了高糖诱导的HRMECs 中MDA含量和LDH 漏出量，提高了细胞中SOD 活性，且呈剂量依赖性，提示荞麦黄酮能够减轻高糖诱导的HRMECs 氧化损伤。此外，持续的高血糖还可诱导HRMECs 发生炎症反应，分泌过量炎症因子促进糖尿病视网膜病变的发展。研究显示，糖尿病视网膜病变患者视网膜组织中IL-6 和TNF-α 呈高表达，促进该疾病的发展［15］。IL-10属于抗炎因子，对IL-6和TNF-α 等促炎因子具有抵抗作用，可缓解糖尿病视网膜病变患者炎症状态［16］。本实验数据显示，荞麦黄酮抑制了高糖诱导的HRMECs分泌IL-6和TNF-α，而促进其分泌IL-10，且呈剂量依赖性，这说明荞麦黄酮可减轻高糖诱导的HRMECs炎症损伤。

HMGB1是一种炎症因子，其参与调控细胞炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等生理或病理过程。研究显示，miR-205-5p 可通过靶向下调HMGB1 减轻缺氧复氧诱导的海马神经元炎症反应和氧化应激，减轻脑缺血再灌注损伤［17］。既往研究显示，HMGB1也参与糖尿病视网膜病变的发生发展，抑制HMGB1基因表达能够改善糖尿病视网膜病变大鼠视网膜中央动脉的血流，并抑制炎症反应及细胞凋亡［18］。本研究结果显示，荞麦黄酮呈剂量依赖性抑制高糖诱导的HRMECs 中HMGB1 mRNA 和蛋白表达，而过表达HMGB1 则逆转了荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs增殖活性、凋亡、氧化应激及炎症反应的影响，进一步提示荞麦黄酮可能通过下调HMGB1 抑制高糖诱导的HRMECs 凋亡、氧化应激及炎症反应。

综上，一定剂量的荞麦黄酮对高糖诱导的HRMECs 凋亡、氧化应激及炎症反应具有显著抑制作用，其作用机制可能与下调细胞中HMGB1 表达有关。HMGB1 受上游miRNA 调控，而miRNA 又受环状RNA 和lncRNA 调控，因此，荞麦黄酮可能通过作用于环状RNA 或lncRNA 进而靶向miRNA 来调控HMGB1 表达，从而减轻高糖诱导的HRMECs 损伤，其具体作用的环状RNA 或lncRNA 及miRNA 有待进一步探究。