BMP9调控Notch、TLR4信号通路诱导主动脉瓣间质细胞成骨样分化

钱 磊 季爱华 张文剑（潍坊市益都中心医院心脏大血管外科，潍坊 262500）

钙化性主动脉瓣疾病（calcified aortic valve disease，CAVD）的主要特点为主动脉瓣纤维增厚和钙化，能够引起主动脉瓣狭窄，最终导致慢性心力衰竭［1］。随着人口的老龄化，CAVD 的发生率逐年升高，并成为常见的心脏瓣膜病［2］。CAVD 病理过程复杂，包括内皮功能障碍、脂质沉积、慢性炎症、细胞成骨分化等，最终导致瓣膜钙化。其中炎症细胞浸润十分关键［3］。目前临床治疗CAVD 只能通过主动脉瓣膜置换术，而缺乏有效药物。因此在CAVD的致病机制上寻找治疗靶点十分重要。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是转化生长因子超家族成员，不但可以诱导骨、软骨，以及皮下、肌肉的异位骨形成，还能调节细胞的增殖、分化和器官形成［4］。在CAVD 的进展中，主动脉瓣膜间质细胞（aortic valve interstitial cells，AVICs）会呈成骨样分化，在分化过程中，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）表达升高［5］。BMP2、BMP4在钙化瓣膜组织中表达升高［6］。而BMP9 与BMP2、BMP4 功能类似，促成骨能力很强［7］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症环境中，BMP9促进人牙周膜干细胞的成骨分化，上调炎症标志物表达［8］。在动脉粥样硬化中，BMP9可驱动血管平滑肌细胞的增殖和迁移，造成局部动脉粥样硬化［9］。但BMP9在CAVD中的作用研究鲜有报道。

本研究的实验前期发现BMP9 在CAVD 患者组织中表达升高，推测BMP9 可能促进瓣膜钙化。由于心脏瓣膜钙化的关键环节是AVICs 的成骨分化，因此本研究以猪AVICs 为研究对象，探讨BMP9 对AVICs 成骨分化的影响，为CAVD 的治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人瓣膜组织和猪AVICs 来源 选择潍坊市益都中心医院的主动脉夹层患者为non-CAVD 组，主动脉钙化患者为CAVD组。取患者主动脉瓣膜组织，一部分于4%多聚甲醛固定，另一部分于液氮保存。所有患者及家属均签署知情同意书。

于潍坊市青州市动物检疫定点屠宰场收集家猪（8～10 月龄，体质量120～150 kg）主动脉瓣膜组织，体外分离培养原代AVICs。本研究通过潍坊市益都中心医院伦理委员会批准（20200512）。

1.1.2 主要试剂及仪器 BMP9 干扰RNA（si-BMP9）、阴性对照干扰RNA（si-RNA）购自广州锐博公司；重组腺病毒BMP7（recombinant adenovirus BMP7，Ad-BMP7）和携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（recombinant adenovirus carrying green fluorescent protein gene，Ad-GFP）购自上海汉恒公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雄激素受体（androgen receptor，AR）染色试剂盒、ALP 染色试剂盒购自上海碧云天公司；M199培养基购自美国Hyclone公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Vimentin、血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，CD31）抗体购自万类公司；BMP9、Runx2、OCN、OPN 抗体购自美国CST 公司；Notch2、发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）、Notch 胞内域（Notch intracellular domain，NICD）、Toll 样受体-4（Toll-like receptor-4，TLR4）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）抗体购自深圳市豪地华拓公司；二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自北京中杉金桥公司；冷冻离心机购自美国Beckman 公司；组织包埋机购自德国Leica 公司；蛋白电泳仪、转膜仪购自美国伯乐公司；电子显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 取出4%多聚甲醛固定的主动脉瓣膜组织并制成石蜡切片，经烘片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱洗、枸橼酸钠缓冲液抗原修复、3%H2O2封闭、血清室温封闭、一抗4 ℃孵育过夜、二抗室温30 min，3，3´-二氨基联苯胺（3，3´-Diaminobenzidine，DAB）显色、苏木素复染，后经梯度乙醇脱水、透明、封片、显微镜（×200）下观察。

1.2.2 猪AVICs 的分离、培养与鉴定 AVICs 的分离、培养：离体主动脉瓣膜用含双抗的PBS漂洗后保存于新鲜M199培养基中，PBS漂洗后用Ⅰ型胶原酶消化组织，将瓣膜剪成小块，于胶原酶中消化过夜。次日离心收集细胞，加入含10%胎牛血清的M199培养基于37 ℃、5%CO2条件中培养，每3 d换液1次。待细胞密度达到80%时消化传代。

免疫荧光鉴定细胞表型：猪AVICs 接种于24 孔板的爬片，待细胞密度达到50%时用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100 破膜，3%H2O2封闭，血清室温封闭，加入α-SMA、Vimentin 和CD31 一抗（1∶50）4 ℃孵育过夜，加入荧光染料标记的二抗（1∶200）室温避光孵育2 h，DAPI 复染细胞核，于荧光显微镜（×200）下观察α-SMA、Vimentin和CD31表达。

1.2.3 猪AVICs 的成骨分化诱导 取对数生长期的AVICs于M199培养基中培养，待细胞密度约50%时向培养基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 µg/ml维生素C、100 nmol/L 地塞米松诱导AVICs细胞成骨分化。

1.2.4 BMP9 处理及实验分组 取对数生长期的AVICs，以2×105个/孔密度铺于6 孔板中，待细胞密度达到约70%时，构建BMP9 基因沉默及过表达体系。转入siRNA，分为control 组（未转染siRNA 的AVICs 细胞）、si-control 组（转染阴性对照siRNA 的AVICs细胞）、si-BMP9组（转染BMP9-siRNA的AVICs细胞）。转染重组腺病毒，分为Ad-GFP组（转染GFP腺病毒的AVICs 细胞）、Ad-BMP9 组（转染BMP9 腺病毒的AVICs细胞）。转染48 h后，提取细胞总RNA用于qPCR 检测；提取细胞总蛋白质用于Western blot检测。

1.2.5 ALP 染色 将转染后的AVICs 细胞接种于24 孔板，各组细胞加入钙盐培养基培养7 d，然后用PBS 洗涤3 次，4%多聚甲醛室温固定后，加入NBT/BCIP 溶液行ALP 染色，避光30 min 后观察染色结果。ALP 染色如细胞质中出现蓝色轮廓，提示细胞内ALP与染料结合。

1.2.6 AR 染色 将转染后的AVICs 细胞接种于24孔板，各组细胞加入钙盐培养基培养14 d，PBS洗涤3 次，4%多聚甲醛室温固定后，加入0.4% AR 染液染色，采用去离子水终止反应，显微镜下观察钙盐沉积情况。茜素红染色细胞外出现深红色钙化结节，提示产生钙质。

1.2.7 qRT-PCR 检测AVICs 中BMP9 及相关成骨指标的mRNA 表达 采用Trizol 法提取AVICs 细胞总RNA。将RNA 反转录为cDNA，并使用SYBR Green 进行扩增，GAPDH 用作内参。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，共40 个循环。使用2-ΔΔCt公式计算BMP9、Runx2、OPN、OCN mRNA 的相对表达水平。BMP9-F：5´-ACGATCTGTTTCCCCTCATCT-3´，BMP9-R：5´-ATGCAGGGATGATGTTCTG-3´。Runx2-F：5´-GCACTACCCAGCCACCTTTA-3´，Runx2-R：5´-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3´。OPN-F：5´-GAGCAAACAGACGATGTGGA-3´，OPN-R：5´-GACCAGCTCATCGGATTCAT-3´。OCN-F：5´-TCACACTGCTTGCCCTACTG-3´，OCN-R：5´-TGCCATAGAAGCGCCGATAG-3´。GAPDH-F：5´-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3´，GAPDH-R：5´-CGTGGGTGGAATCATACTGGA-3´。

1.2.8 Wertern blot 检 测CAVD 组织和AVICs 中BMP9、相关成骨指标及Notch、TLR4 信号通路蛋白表达 取部分CAVD 组织和AVICs，加入适量RIPA组织裂解液进行总蛋白提取，并测定各组蛋白浓度，缓冲液稀释后进行SDS-PAGE 分离蛋白，电泳完毕后迅速转至PVDF 膜，于TBST 中室温封闭2 h，分别加入BMP9、Runx2、OPN、OCN、Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 一抗（1∶2 000）4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次后，加入二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，最后避光加入ECL显色剂显色，Bio-Rad凝胶成像仪记录蛋白灰度并拍照，以GAPDH 作为对照，对各组蛋白表达进行相对定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料用表示。两组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Runx2、BMP9 在CAVD 组织中的表达 免疫组化结果（图1A）及Western blot（图1B）结果显示，与non-CAVD 组相比，CAVD 组中Runx2、BMP9 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。说明BMP9能够促进瓣膜钙化，且在CAVD的进展中起重要作用。

2.2 猪AVICs 的形态及表型鉴定 接种24 h 后，AVICs 细胞呈长梭形，形态趋于一致，呈放射状（图2A）；免疫荧光染色结果显示，α-SMA（图2B）、Vimentin（图2C）阳性表达；而CD31阴性表达（图2D）。说明原代猪AVICs分离成功。

图2 猪AVICs的形态及表型鉴定（×200）Fig.2 Morphology and phenotype identification of pig AVICs（×200）

2.3 BMP9促进猪AVICs的成骨分化 ALP染色结果（图3A）显示，与si-control组相比，si-BMP9组蓝紫色染色结节明显减少，ALP 活性降低（P<0.05）；与Ad-GFP 组相比，Ad-BMP9 组蓝紫色染色结节明显增多，ALP 活性升高（P<0.05）。茜素红染色结果（图3B）显示，与si-control组相比，si-BMP9组红色钙化结节明显减少，茜素红浓度降低（P<0.05）；与Ad-GFP 组相比，Ad-BMP9 组深红色钙化结节明显增多，茜素红浓度升高（P<0.05）。qRT-PCR（图3C）和Western blot（图3D）结果显示，与si-control 组相比，si-BMP9组BMP9、Runx2、OPN和OCN mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与Ad-GFP 组相比，Ad-BMP9 组BMP9、Runx2、OPN 和OCN mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。提示BMP9能够促进AVICs成骨分化，并提高成骨指标表达。

图3 BMP9促进猪AVICs的成骨分化Fig.3 BMP9 promotes osteogenic differentiation of pig AVICs

2.4 BMP9对Notch、TLR4信号通路的影响 Western blot结果（图4）显示，与si-control组相比，si-BMP9组Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与Ad-GFP 组相比，Ad-BMP9组Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。说明BMP9 可能通过Notch 和TLR4 信号通路调节AVICs 细胞的成骨样分化。

图4 BMP9对Notch、TLR4信号通路的影响Fig.4 Influence of BMP9 on Notch and TLR4 signaling pathway

3 讨论

CAVD 是一种活跃的、细胞驱动的退行性疾病。健康瓣膜中AVICs 保持静止，维持成纤维细胞样特征，但在CAVD 中AVICs 会呈成骨样分化，并伴有Runx2、OPN、OCN 和ALP 表达升高［10-11］。在骨形成及心脏瓣膜发育中，BMPs 起重要作用。研究发现BMP2、BMP4、BMP7 在CAVD 中表 达升 高，表明BMPs 家族与CAVD 相关［12-14］。BMP2 的主要作用为直接诱导钙化，而BMP9 主要参与内皮病变。瓣膜钙化过程中，最初表现为内皮细胞损伤和上皮-间质转化，但最终将转化为AVICs 表型［15］。研究发现，BMP9 可诱导VCAM-1 和ICAM-1 表达，引起血管炎症，进而诱导局部的动脉粥样硬化，且BMP9 也能使血管平滑肌细胞发生钙化，表明BMP9 在钙化过程中发挥关键作用［16-17］。本研究证实，在CAVD 组织中BMP9 表达升高，推测BMP9可能在CAVD 中起重要作用。通过构建低表达和过表达BMP9 的AVICs发现敲减BMP9后，Runx2、OPN、OCN 等成骨指标表达降低，同时ALP 染色变浅，钙盐沉积减少；BMP9过表达后，Runx2、OPN、OCN 表达增加，ALP 染色变深，钙盐沉积增加，说明BMP9 能够促进AVICs 成骨分化。

Notch 信号通路能够调控细胞的增殖、分化及凋亡等生理过程，同时Notch 信号通路在诱导成骨细胞分化及内皮细胞钙化中起重要作用。如谢正松等［18］发现过表达BMP4通过激活Notch 信号通路，促进骨髓基质细胞成骨分化。MAJUMDAR 等［19］发现Notch 信号通路可促进血管平滑肌细胞钙化。ZENG 等［20］研究表明Notch 信号通路在人心脏瓣膜间质细胞钙化过程中发挥重要的促进作用。许多研究表明慢性炎症反应参与退行性瓣膜钙化。TLR4是一种模式识别受体，可表达于主动瓣膜间质细胞，能够诱导膜间质细胞的成骨分化和造成炎症反应。如ZHENG 等［21］发现主动瓣膜间质细胞中TLR4、NF-κB 水平上调，miR-214 通过激活TLR4 通路促进钙化。SHEN 等［22］发现小鼠主动瓣膜间质细胞钙化区中TLR4表达水平增加，TLR4基因敲除后，主动脉瓣间质细胞钙化程度明显减弱。本研究中敲减BMP9 后，Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水平降低；过表达BMP9 后，Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水平升高，说明BMP9可能通过激活Notch 和TLR4信号通路发挥促钙化作用，见图5。

图5 BMP9诱导猪AVICs成骨分化的作用机制Fig.5 Mechanism of BMP9 inducing osteogenic differentiation of pig AVICs

综上所述，BMP9 能够促进AVICs 的成骨样分化，这一作用机制可能与Notch 和TLR4 信号通路的激活有关。为CAVD 的治疗提供了理论和实验依据。抑制AVICs BMP9 表达或阻断Notch 和TLR4 信号通路，可能会延缓瓣膜钙化进程。