鼠李糖乳杆菌zrx01 冻干菌粉的制备及工艺优化

杜晗笑,冉军舰,孙俊良,邓艳文,李瑞雪,庞帅

（河南科技学院食品学院,河南 新乡 453003）

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhanmnosusGG）是兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点[1],可在人和动物肠道中定植,具有预防腹泻、提高机体免疫力和保护胃黏膜等功能[2-4],被广泛应用于发酵乳制品、干酪、果汁饮料和药品等行业中[5].随着国际组织对益生菌制剂的重视及市场需求的稳定增加,生产高密度、高稳定性的益生菌冻干菌粉已成为当前研究热点.但目前市场上冻干菌粉普遍存在的活菌含量低、贮藏稳定性不佳等问题急需解决.

真空冷冻干燥是制备冻干菌粉最常见的方法之一,但在冷冻干燥过程中存在活细胞损伤严重、活菌含量低、活菌下降迅速等问题[6-7].冻干过程中选择适合的冻干保护剂如糖、蛋白质和氨基酸类等,可以减少细胞的物理化学损伤,保持细胞活性[8-10].目前,已有相关研究表明保护剂在防止低温损伤、提高细菌冻干存活率方面的作用,但由于不同菌种间存在生物学差异,因此需针对特定菌株进行评估和调整[11-14].另外,在市场应用中,无法保证菌粉贮藏期间的细菌活性也是一大问题.因此,探究不同保护剂对鼠李糖乳杆菌保护效果,建立合理可行的菌粉制备工艺,对提高冻干菌粉的活菌数及贮藏稳定性具有重要意义.

本研究从开菲尔粒中筛选一株高产细菌素的专利菌株鼠李糖乳杆菌zrx01,通过确定菌体离心条件,以冻干存活率为评定指标,在单因素试验基础上对7 种冻干保护剂进行响应面工艺优化并测定菌粉活菌数与稳定性,为活性高、稳定性好的鼠李糖乳杆菌zrx01 冻干菌粉制备和研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosuszrx01,GenBank No.KY348290）,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.15076,专利号CN201810181018.4.

1.1.2 试剂脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠、蔗糖、甘油,河南华瑞生物科技有限公司；MRS 培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司.以上试剂均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH 计,上海盛磁仪器有限公司；SPX-250 型生化培养箱,上海跃进医疗器械厂；ZQTY-70N振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司；SW-CJ-1D 单人单面垂直净化工作台,苏州智净净化设备有限公司；湘仪H2050R 台式高速冷冻离心机,长沙湘仪离心机有限公司；Thermo 900 系列超低温冰箱,郑州金友宁仪器有限公司；CHRIST ALPHA 1-4 LSC 型冷冻干燥机,德国CHRIST 公司.

1.3 鼠李糖乳杆菌菌种扩大培养

将-80 ℃甘油保藏的鼠李糖乳杆菌用接种环取样,接种到MRS 液体培养基中,在37 ℃、180 r/min摇床中培养24 h,活化2~3 次,得到活化菌种.将活化好的种子菌液按1%的接种量接种至MRS 液体培养基中,于37 ℃、180 r/min 摇床中培养18 h 至对数期备用.

1.4 鼠李糖乳杆菌离心条件的选择

将30 mL 鼠李糖乳杆菌菌液置于50 mL 离心管中,离心温度4 ℃,分别在离心转速4 000、6 000、8 000 r/min 离心条件下离心10、15、20 min,弃上清液收集菌泥,生理盐水洗涤2~3 次,加入等体积的生理盐水充分混匀,采用平板计数法计算活菌总数,按式（1）计算离心收获率

1.5 冻干菌悬液的制备及真空冷冻干燥

收集乳酸菌菌泥,按照原菌液体积的1/10 加入保护剂混合均匀,于-80 ℃预冻4 h 后进行真空冷冻干燥.干燥条件为：冷阱温度-70 ℃,干燥时间24 h,真空度1 Pa.冻干完成后加入等体积生理盐水充分混匀,采用平板计数法测定冻干前后乳酸菌单位体积活菌数,按式（2）计算冻干存活率

1.6 单因素试验

糖、蛋白质和氨基酸等物质是最常见的低温保护剂,确定合适的保护剂是提高细胞存活率的关键.通过查阅文献并结合试验成本,选择7 种常用的冻干保护剂脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠、蔗糖和甘油[15-21],以冻干存活率为评定指标,通过单因素试验研究不同保护剂对鼠李糖乳杆菌的冻干保护作用.

1.6.1 脱脂乳粉对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为4%、8%、12%、16%和20%的脱脂乳粉充分混匀,海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠、蔗糖和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.2 海藻糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为4%、8%、12%、16%和20%的海藻糖充分混匀,脱脂乳粉、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠、蔗糖和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.3 乳糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为6%、12%、18%、24%和30%的乳糖充分混匀,脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇、谷氨酸钠、蔗糖和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.4 山梨醇对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为3%、5%、7%、9%和11%的山梨醇充分混匀,脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、谷氨酸钠、蔗糖和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.5 谷氨酸钠对鼠李唐乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为1%、2%、3%、4%和5%的谷氨酸钠充分混匀,脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、蔗糖和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.6 蔗糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入质量分数为1%、2%、3%、4%和5%的蔗糖充分混匀,脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠和甘油的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.6.7 甘油对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响收集离心菌泥,分别加入体积分数为2%、4%、6%、8%和10%的甘油充分混匀,脱脂乳粉、海藻糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸钠和蔗糖的添加量为0,以添加生理盐水组为对照组进行冻干,冻干完成后添加生理盐水复溶30 min,计算活菌数及冻干存活率.

1.7 响应面法优化试验

基于单因素试验结果,选择脱脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸钠四个因素,以鼠李糖乳杆菌冻干存活率为指标,通过Box-Behnken 设计响应面优化试验.

1.8 冻干菌粉贮藏稳定性

将真空冷冻干燥后的冻干菌粉装入经灭菌处理的玻璃瓶中避光保存,分别在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下贮藏0、30、60、90 d,与初始冻干菌粉比较,测定不同温度条件下鼠李糖乳杆菌贮藏期间的存活率.贮藏期间的存活率按式（3）计算

1.9 数据处理

采用SPSS24 软件进行单因素方差分析（ANOVA）,以P＜0.05 为显著性检验标准；采用Design-Expert 8软件进行Box-Behnken 试验设计；采用Origin 2022 进行图形绘制；试验结果用平均值±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌离心条件的确定

不同离心条件下鼠李糖乳杆菌离心收获率试验结果见表1.

表1 不同离心条件下离心收获率Tab.1 Table of centrifugal harvest rate under different centrifugal conditions

由表1 可知,在离心转速为4 000 和8 000 r/min 时,离心存活率较低,这是因为在4 000 r/min 条件下离心作用力较小,上清液中的菌体无法完全沉积；当离心转速为8 000 r/min 时,离心作用强,菌体在离心过程中受到严重的机械损伤,从而导致部分细胞死亡.在离心转速为6 000 r/min,时间为15 min 时离心收获率最高达到了91.21%,与其它组别相比具有显著性差异.因此确定离心转速6 000 r/min,离心时间15 min 为鼠李糖乳杆菌的离心收集条件.

2.2 单因素试验结果

2.2.1 脱脂乳粉对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响脱脂乳粉是一种复杂的物质,由乳糖、蛋白质和微量元素组成,其中牛乳蛋白能够在细胞表面形成黏性的保护层,在冷冻干燥过程中减少细胞损伤[22].不同质量分数脱脂乳粉对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图1.

图1 脱脂乳粉对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.1 Effects of skin milk powder on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图1 可知,随着脱脂乳粉质量分数增加,鼠李糖乳杆菌冻干存活率呈先上升后下降的趋势,当质量分数为12%时,菌体存活率最高为70.67%,质量分数持续升高,冻干存活率开始下降.Latife 等[23]研究不同保护剂对曲拉氏乳杆菌N19 冻干的保护作用,结果表明脱脂乳粉对菌体冻干存活率影响最为显著,与本研究结果基本一致.这是由于脱脂乳粉能够在细胞壁与细胞膜之间形成粘性保护层,具有减少细胞冻干损伤的作用；但在保护剂质量分数持续升高时会使环境渗透压过高,导致部分细胞脱水死亡,使冻干存活率降低.综上,质量分数为12%脱脂乳粉对鼠李糖乳杆菌冻干的保护效果最佳.

图2 海藻糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.2 Effects of trehalose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图2 可知,随着海藻糖质量分数升高,鼠李糖乳杆菌冻干存活率呈现先升高后缓慢下降趋势.海藻糖质量分数为4%时,冻干存活率较低；质量分数为8%时,冻干存活率最高,为69.70%；当质量分数持续升高,冻干存活率呈缓慢下降趋势.李大鹏等[2]研究海藻糖对植物乳杆菌冻干存活率的影响,结果表明随着海藻糖浓度升高,植物乳杆菌冻干存活率先升高后趋于平缓,最高达60%以上,与本研究结果基本一致,这可能是由于海藻糖能够填充到细胞在冻干过程中因蛋白质失水形成的空缺中,形成一个玻璃状保护层,有效提高冻干菌存活率,但保护剂质量分数过高则会导致细胞玻璃化结构过强,影响菌体自身结构,使存活率降低.综上,质量分数为8%时海藻糖对鼠李糖乳杆菌冻干保护效果最佳.

2.2.3 乳糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响在冷冻干燥过程中,乳糖可以显著提高细胞玻璃化相变温度,从而减少细胞内冰晶的形成,达到保护细胞的作用[25-26].不同质量分数乳糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图3.

图3 乳糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.3 Effects of lactose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图3 可知,当乳糖质量分数在6%~18%时,随乳糖质量分数增大,鼠李糖乳杆菌冻干存活率显著提升,最高达71.64%；当乳糖质量分数大于18%时,鼠李糖乳杆菌冻干存活率反而下降.Cui 等[27]研究表明乳糖显著提高了短乳杆菌173-1-2 冻干存活率,最高可达70%,与本研究结果一致.这是由于乳糖作为小分子半透溶质,可以在不进入细胞膜的情况下渗透细胞壁,保护该空间膜稳定性,防止因冰晶形成而造成的细胞损伤；但保护剂质量分数过高可能会导致细胞失水死亡,使冻干存活率降低.综上,质量分数为18%时,乳糖对鼠李糖乳杆菌冻干保护效果最佳.

2.2.4 山梨醇对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响山梨醇具有多个羟基,在冻干过程中可与菌体蛋白质极性基团结合形成氢键,稳定蛋白质的结构与功能[28].不同质量分数山梨醇对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图4.

图4 山梨醇对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.4 Effects of sorbitol on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图4 可知,随着山梨醇质量分数升高,鼠李糖乳杆菌冻干存活率呈先升高后下降的趋势,在7%时存活率最高,为50.18%；当质量分数大于7%时,冻干存活率极速下降.这是由于山梨醇作为多元醇类化合物,具有保护菌体免受失水损伤和维持细胞活力的作用[29],而高渗透压环境则不利于细胞存活,使细胞失水损伤,从而影响冻干存活率.综上,在质量分数为7%时山梨醇对鼠李糖乳杆菌冻干保护效果最佳.

2.2.5 谷氨酸钠对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响谷氨酸钠具有抗氧化作用,可以抑制三酰甘油的氧化作用和自由基的形成,保护细胞膜受到不可逆的损伤[3].不同质量分数谷氨酸钠对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图5.

图5 谷氨酸钠对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.5 Effects of sodium glutamate on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图5 可知,随谷氨酸钠质量分数升高,鼠李糖乳杆菌冻干存活率呈先上升后下降趋势,在2%时达到最高,冻干存活率为70.67%；当保护剂质量分数大于2%时,存活率开始下降.周佳豪等[30]研究谷氨酸钠对干酪乳杆菌冻干存活率的影响,结果表明当谷氨酸钠浓度为1.5%时存活率最高,浓度大于1.5%时呈下降趋势,与本研究结果基本一致.这可能是由于谷氨酸钠能够进入细胞内,起到减缓冰晶生长和防止细胞损伤的作用；当溶液质量分数升高时,进入胞内谷氨酸钠含量也偏高,导致部分活性物质失活,反而不利于保持细胞保存.综上,2%谷氨酸钠对鼠李糖乳杆菌保护作用最佳.

2.2.6 蔗糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响蔗糖在冻干时可以抑制细胞膜发生相变使细胞保持液晶态稳定结构[31].不同质量分数蔗糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图6.

唐朝有和尚，号圆泽，与朋友李源善（一称李源）外出，见一孕妇在河边汲水，圆泽对李说：这妇人怀孕已三年，只待我去投胎，我一直避着，现在遇见没有办法了。三天之后，你到她家去看，如婴孩对你笑一笑，就是我了；再过13年（一称12年）中秋月夜，我将在杭州天竺寺等你。说罢那夜国泽圆寂，孕妇生一男孩，第三天李去探看，婴儿果然对地笑了一笑。13年后中秋夜，李源善到天竺寺，见一牧童坐在牛背上唱歌道：“三生石上旧精魂，赏月吟风不要论，惭愧情人远相访，此身虽异性常存。”李听了叹道国泽与这牧童真是有三生的缘分啊。

图6 蔗糖对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响Fig.6 Effects of sucrose on freeze-dried survival rate of Lactobacillus rhamnosus

由图6 可知,在蔗糖质量分数为1%~3%时,鼠李糖乳杆菌冻干存活率呈上升趋势,在3%时达到最高,为49.21%,而后开始降低.这可能是由于蔗糖能够形成保护层,具有保护细胞结构的作用,但保护剂质量分数升高会加速细胞内蛋白质的聚合,形成过强的玻璃化结构,反而不利于细胞保存.综上,质量分数为3%蔗糖对菌体冻干保护作用最佳.

2.2.7 甘油对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响不同体积分数甘油对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图7.

由图7 可知,不同甘油体积分数条件下鼠李糖乳杆菌冻干存活率在6%~8%之间,与对照组冻干存活率7.39%相比无显著差异.景安琪等[32]研究不同保护剂对乳酸乳球菌冻干存活率的影响,结果表明脱脂乳、海藻糖和谷氨酸钠冻干保护效果最好,甘油、菊粉和谷胱甘肽冻干保护效果较差.谭莎莎等[33]研究不同类型保护剂对罗伊氏乳杆菌138-1 冻干存活率的影响, 结果发现可渗透进细胞壁的保护剂如糖、醇类物质冻干保护效果最佳,可渗透进入细胞膜的保护剂如甘油、赤藓糖醇保护效果不佳,与本研究结果一致,说明单独使用甘油对菌体的保护作用有限.然而也有研究表明甘油单独使用时也具有良好的冻干保护效果,与本研究结果相反,这可能是由于不同菌株间的生物学差异造成的.

2.3 响应面试验结果及方差分析

由单因素试验结果可知,脱脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸钠冻干保护效果显著优于山梨醇、谷氨酸钠和甘油,因此选择脱脂乳粉、海藻糖、乳糖和谷氨酸钠四种因素为自变量,以冻干存活率为响应值,采用Box-Behnken 设计四因素三水平响应面试验,试验因素水平见表2.

表2 响应面试验因素水平表Tab.2 Response surface test factor level table%

在单因素试验的基础上,采用响应面法进一步优化鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方,响应面试验设计与结果见表3.以A、B、C、D 四个因素为自变量,鼠李糖乳杆菌冻干存活率（Y）为因变量,进行四因素三水平的中心组合试验,采用Design-Expert 软件进行响应面拟合.得到二次多项回归方程如下：

表3 响应面试验设计与结果Tab.3 Response surface experimental design and results

（续表3）

式（3）中Y为鼠李糖乳杆菌冻干存活率,A、B、C、D 分别代表脱脂乳粉、谷氨酸钠、乳糖、海藻糖.

通过联合假设检验（F检验）分析回归模型并进行方差分析,方差分析结果见表4.

表4 响应面试验结果与方差分析Tab.4 Response surface experimental results and analysis of variance

由表4 可知,模型F值为21.30,P＜0.000 1,检验结果显著,失拟项F值为1.32,P=0.469 2,失拟项检验结果不显著,说明该回归方程拟合程度良好.模型决定系数R2=0.955 2,可用于鼠李糖乳杆菌冻干存活率的理论预测和分析.由Radj=0.910 3 可知,此回归方程具有较好的拟合程度.模型的二次多项回归方程的回归系数差异性分析结果为：模型一次项系数A（脱脂乳粉）、B（谷氨酸钠）、D（海藻糖）极显著,C（乳糖）高度显著,AC、BC、BD 和CD 交互作用显著（P＜0.05）,AB 和AD 交互作用不显著.由F 值可知,各因素对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响程度由大到小为：B（谷氨酸钠）＞D（海藻糖）＞A（脱脂乳粉）＞C（乳糖）.

2.4 响应曲面各因素交互作用分析

响应曲面平缓与陡峭以及等高线的稀疏和密集很大程度上反应了鼠李糖乳杆菌冻干存活率对各因素的敏感性,若响应面陡峭,则表明保护剂质量分数的变化对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响较为显著,反之则不敏感[34].各因素交互作用对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响见图8.

图8 为各个因素两两交互的三维空间响应面图与等高线图,代表当两组因素水平为零时,另外两组因素的交互作用对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响.由图8 可知,图8-b、8-d、8-e 和图8-f 响应曲面变化较为明显,等高线图呈椭圆形,说明AC、BC、BD 和CD 交互作用显著,且与其它因素相比,沿谷氨酸钠方向响应曲面变化更陡峭,等高线更密集,说明谷氨酸钠对鼠李糖乳杆菌冻干存活率的影响最显著；图8-a 和图8-c 响应面曲面变化较缓,等高线密集程度无明显差异,说明AB、AD 之间交互作用不显著,与方差分析结果一致.

2.5 最佳试验条件预测及验证

经模型预测得鼠李糖乳杆菌最优冻干保护剂配方为：脱脂乳粉16.00%、谷氨酸钠2.69%、乳糖15.12%、海藻糖9.56%,冻干存活率预测值为90.97%.在考虑实际情况和操作方便的条件下,选择保护剂在脱脂乳粉16.00%、谷氨酸钠2.70%、乳糖15.10%和海藻糖9.60%的条件下进行验证试验,重复三次最终得到鼠李糖乳杆菌的冻干存活率为（90.12±1.04）%,与模型理论预测值的误差为0.93%,测得菌粉含菌量为（1.20±0.07）×1011CFU/g.结果表明经响应面优化的鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方合理可行.

2.6 贮藏条件对鼠李糖乳杆菌冻干菌粉存活率的影响

本研究分析不同贮藏温度和时间对冻干菌粉存活率的影响,试验结果见图9.

图9 贮藏条件对鼠李糖乳杆菌冻干菌粉存活率的影响Fig.9 Effects of storage conditions on survival rate of lyophilized Lactobacillus rhamnosus powder

由图9 可知,随着贮藏时间延长,冻干菌粉存活率呈下降趋势.在-20 ℃贮藏的菌粉的存活率略高于4 ℃,显著高于25 ℃（P＜0.05）,在-20 ℃、4 ℃和25 ℃贮藏90 d 冻干菌粉存活率分别为82.22%、76.39%和65.00%,存活率达到65%及其以上,表明该菌种具有良好的贮藏稳定性,可在一定程度上提高冻干菌粉品质,延长产品货架期.

3 结论

本研究确定鼠李糖乳杆菌zrx01 的最佳离心条件为离心转速6 000 r/min、离心时间15 min,在此条件下,离心收获率达到91.21%；在单因素试验基础上对冻干保护剂配方进行响应面工艺优化最佳配比为脱脂乳粉16.00%、谷氨酸钠2.69%、乳糖15.12%、海藻糖9.56%,冻干菌粉的存活率为（90.12±1.04）%,菌粉含菌量为（1.20±0.07）×1011CFU/g；菌粉在-20 ℃、4 ℃和25 ℃贮藏90 d 存活率分别为82.22%、76.39%和65.00%.