UPLC-PDA快速检测即食性蔬菜中氯虫苯甲酰胺、甲基硫菌灵和多菌灵残留

王建华,王首萌,屈淑帆,乔雪阳,王晓,李广领

（河南科技学院资源与环境学院,河南 新乡 453003）

即食性蔬菜是指采摘后通过简单清洗可直接食用或采用调味（或不调味）工艺加工而成的蔬菜产品[1],例如瓜菜类的黄瓜、苦瓜、佛手瓜等,果菜类的茄子、西红柿、甜椒等,叶菜类的生菜、卷心菜、苦苣等.这类蔬菜的突出特点是食用方便.此外,由于不经过烹饪加工过程,即食性蔬菜能保持蔬菜原本口感,且营养成分不会被破坏.但因即食性蔬菜作物生长周期相对较短,其生长过程中为防控病虫侵袭而施用的农药就特别容易使蔬菜产品农药残留超标,且其产生的农药残留安全风险要远高于生长周期较长的常规蔬菜产品.随着人们食品安全意识不断增强,农药残留风险更高的即食性蔬菜产品质量安全倍受关注.

氯虫苯甲酰胺（Chorantraniliprole）是美国杜邦公司于2000 年研发的邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂,作为昆虫鱼尼丁受体高效激活剂,对危害多种作物的重要鳞翅目和双翅目害虫防效优异[2]；甲基硫菌灵（Thiophanate-methyl）是1969 年由日本曹达公司研发的苯并咪唑类广普性杀菌剂,其植物代谢转化产物多菌灵（Carbendazim）同样具有广普杀菌活性[3].氯虫苯甲酰胺熔点为208 ℃~210 ℃、330 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）为2.86,pKa（20 ℃）为10.88,大鼠急性经口LD50大于5 000 mg/kg；甲基硫菌灵熔点为172 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）为1.40,pKa（20 ℃）为7.2,碱性条件下易分解,大鼠急性经口LD50为6 640~7 500 mg/kg；多菌灵熔点为307 ℃~312 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）为1.51（pH 7.0）,pKa（25 ℃）为4.48,碱性环境下不稳定[4].其中多菌灵为甲基硫菌灵在植物体内的毒理学意义代谢物,大鼠急性经口LD50大于15 000 mg/kg,2017 年JMPR 将用于植物产品中膳食风险评估的甲基硫菌灵残留物定义为甲基硫菌灵及多菌灵之和,结果以多菌灵表达[5].我国现行食品安全标准[6]规定生菜、黄瓜和西红柿中甲基硫菌灵最大允许残留限量（MRLs）分别为5 mg/kg、2 mg/kg 和3 mg/kg；生菜、黄瓜和西红柿中氯虫苯甲酰胺的MRLs 分别为5 mg/kg、0.3 mg/kg 和0.6 mg/kg.目前报道的蔬菜中氯虫苯甲酰胺、多菌灵和甲基硫菌灵残留分析方法有分光光度法[7-9]、液相色谱法[10-14]、液质联用法[15-18]和酶免疫测定法[19-22]等.分光光度法虽然仪器成本低、操作简单,但易受样品基质干扰且检测灵敏度较低；气相色谱法需经过复杂的化学衍生化过程[23-24]；而酶免疫测定法存在着因样品基质干扰造成假阳性检测结果概率较高的问题.液相色谱法适宜于样品中分子量大、极性范围宽、高沸点及易热分解的农药残留分析.另外,在仪器成本和对操作人员技术要求方面又较色谱质谱联用技术具有优势,是农产品农药残留分析的常用仪器平台.

当前农业生产实践中,菜农在病虫害防控药剂品种选择、用药次数和施药剂量等方面的不规范和不合理现象仍较普遍.另外,因菜农对安全间隔期的重视不够,对一些生长周期内多次采摘的蔬菜,违反安全间隔期采摘、销售的现象也很普遍.因此,因农药的不科学和不合理使用带来的农产品农药残留安全风险不容忽视.本研究在已报道的相关分析方法基础上,拟建立当前蔬菜生产广泛使用的杀虫剂（氯虫苯甲酰胺）和杀菌剂（甲基硫菌灵、多菌灵）在有广泛代表性的瓜菜（黄瓜）、果菜（西红柿）和叶菜（生菜）三种典型即食性蔬菜样品中残留的QuEChERS 简易样品前处理程序和符合农药残留分析要求的UPLC-PDA 分析方法,以期为农药残留检测和监测提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1 000 mg/L氯虫苯甲酰胺标准溶液,天津阿尔塔科技有限公司；1 000 mg/L多菌灵标准溶液和1 000 mg/L甲基硫菌灵标准溶液,国家标准物质研究中心；HPLC 级乙腈,美国Mreda 公司；分析级氯化钠、无水硫酸镁和乙腈等,国药集团化学试剂有限公司；PSA、C18、GCB 和NANO,天津博纳艾杰尔科技有限公司.

UPLC-PDA 系统（配置真空脱气机、自动进样器、二元泵、柱温箱和PDA 检测器、Empower 3 数据采集和处理系统）,美国Waters 公司；VORTEX3 涡旋混合仪,德国IKA 公司；TDL-5000B 型大容量冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂；GTR16-2 型高速冷冻离心机,北京时代北利离心机有限公司；HGBTWTS3型均质仪,美国Waring 公司；YP5002 电子天平,上海佑科仪器仪表有限公司.

试验样品源自实验田培育生菜、黄瓜和西红柿,两年内以上三种农药历史,样品经均质化后用塑封袋密封装.

1.2 试验方法

1.2.1 色谱分析条件优化以ACQUITY UPLCRBEH C18色谱柱（2.1×100 mm,1.7 μm）为分离分析柱,设置30 ℃柱温,以乙腈和水为色谱分析流动相,柱流速0.3 mL/min.在此基础上,通过使用不同体积比的色谱流动相考察样品基质中三种目标分析物的出峰情况,同时兼顾样品分析时长,确定目标分析物与样品基质获得良好分离的色谱流动相；通过对三种目标分析物紫外全扫描（210 nm~400 nm）,兼顾检测灵敏度和样品基质干扰情况,确定最佳的PDA 检测波长,以不同体积的三种目标分析物进样分析,考察目标分析物峰形,结合仪器检测灵敏度和最低定量校准水平,确定最佳进样体积.最终获得目标分析物出峰时间适中、峰形良好、无样品基质干扰和灵敏度高的色谱分析条件.

1.2.2 分析样品制备称取10±0.1 g 均质化的黄瓜、西红柿和生菜空白样品放入50 mL 离心管,在样品管中加入10 mL 样品提取液（含0.1%乙酸的乙腈溶液）和2 g 氯化钠,涡旋提取3 min,再在30 ℃水浴中超声提取5 min；4 500 r/min 离心5 min,转移1 mL 上清液至2 mL 净化管（预装100 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO）,涡旋1 min；10 000 r/min 离心5min.上清液通过0.22 μm 针头过滤器转移至进样小瓶,待色谱分析.

1.2.3 分析方法性能验证用三种蔬菜的乙腈提取液稀释氯虫苯甲酰胺、甲基硫菌灵和多菌灵标准溶液,配制系列质量浓度的基质标准工作溶液,在优化色谱条件下进样分析,以质量浓度为横坐标、对应的色谱响应值为纵坐标建立基质标准曲线,求得线性回归方程和相关系数；再分别以10 倍信噪比测定并计算定量检测限（LOQ）.

将1 mL 适宜质量浓度的三种目标分析物的混合标准溶液分别添加至盛装10±0.5 g 均质化的黄瓜、西红柿和生菜空白样品的50 mL 离心管,涡旋混匀3 min 后静置30 min,得添加水平分别为1 mg/kg、0.5 mg/kg 和0.1 mg/kg 的标样添加样品,空白对照样品不加混合标样而添加1 mL 乙腈；然后按1.2.2 所述的分析样品制备程序进行样品制备,采用1.2.1 确定的色谱分析条件进行样品分析.根据建立的基质标准曲线进行外标法定量较准,根据分析结果计算回收率及各添加水平5 个平行样品间的相对标准偏差（RSD）.

2 结果与分析

2.1 色谱分析条件

用UPLC-PDA 对三种目标分析物进行紫外全扫描得到相应的紫外吸收光谱（见图1）.在色谱流动相优化过程中发现,以乙腈（B）和水（A）为梯度洗脱流动相,设置梯度洗脱程序（0~3 min,30%B；7.0 min,65%B；8.0 min,95%B；10.0 min,95%B；10.1 min,30%B；15.0 min,30%B）,在35 ℃柱温、0.3 mL/min 流动相流速、3 μL 进样体积和254 nm 紫外检测波长下可获得三种蔬菜中三种目标分析物稳定良好的分离效果.

图1 三种目标分析物的紫外吸收光谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectras of the three target analytes

图2 为三种目标分析物的典型色谱图,图3~5 分别为生菜、西红柿和黄瓜空白样品及标样添加样品色谱图.

图2 三种目标分析物的典型色谱图Fig.2 Typical chromatograms of three target analytes

图3 生菜空白样品和标样添加样品色谱图Fig.3 Chromatogram of lettuce blank samples and spiked samples

图4 西红柿空白样品色谱图和标样添加样品色谱图Fig.4 Chromatogram of tomato blank samples and spiked samples

图5 黄瓜空白样品色谱图和标样添加样品色谱图Fig.5 Chromatogram of cucumber blank samples and spiked samples

2.2 分析方法的线性检测范围

在优化的UPLC-PDA 色谱条件下,对0.01 mg/L~5 mg/L 系列质量浓度的氯虫苯甲酰胺、甲基硫菌灵和多菌灵的基质标准溶液进行分析, 发现三种目标分析物的不同质量浓度与对应的色谱响应值均有良好线性响应.多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺的定量校准曲线方程分别为y=22 125x-608.4（R2=0.999 5）、y=25 994x-575.36（R2=1）和y=17 254x-55.564（R2=1）.

2.3 方法的准确度和精密度

用回收率和不同添加水平多次平行样品间的标准偏差衡量分析方法的准确度和精密度.表1 至表3 为黄瓜、西红柿和生菜空白样品中多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺的回收率试验结果.表1~3 显示,三种蔬菜样品中的多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺平均回收率为76%~115%,RSD 为1%~9%.通过在黄瓜、西红柿和生菜空白样品提取液中添加适当质量浓度的多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺标准溶液,测得黄瓜样品中多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺中的LOQ 分别为0.017 mg/kg、0.034 mg/kg和0.032 mg/kg；西红柿中LOQ 分别为0.026 mg/kg、0.041 mg/kg 和0.012 mg/kg；生菜中LOQ 分别为0.038 mg/kg、0.043 mg/kg 和0.035 mg/kg.

表1 多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺在黄瓜中不同添加水平的回收率Tab.1 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in cucumber（n=5）

表2 多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺在西红柿中不同添加水平的回收率Tab.2 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in tomato（n=5）

表3 多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺在生菜中不同添加水平的回收率Tab.3 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in lettuce（n=5）

从表1~3 中的回收率数据看,所开发的分析方法的准确度和精密度符合农药多残留分析要求,方法检测限能满足GB 2763-2021 中三种蔬菜中三种农药残留MRLs 标准[6].

3 结论与讨论

本研究在色谱分析方法建立环节分别尝试用不同体积比的乙腈和水为流动相,考察目标分析物和样品基质的分离情况,发现以乙腈和水作流动相按设定程序梯度洗脱能保证多菌灵、甲基硫菌灵和氯虫苯甲酰胺合适的色谱保留时间,且峰形端正、对称性好、无样品基质干扰.此外,为避免实验室温度变化对目标分析物色谱保留时间及分离效果的影响,设定35 ℃的色谱柱温.另外,分别测试了2 μL、3 μL 和5 μL三种进样体积下的色谱出峰效果,发现进样量为5 μL 时多菌灵和甲基硫菌灵峰型较宽且有明显拖尾现象,考虑到2 μL 的进样量可能影响样品中目标分析物的检测灵敏度,因此,以3 μL 的进样体积为优化进样量.在紫外检测波长选择方面,兼顾流动相紫外吸收截止波长和检测灵敏度,选择254 nm 为检测波长.

在农药残留分析样品制备程序中,C18 主要用于去除脂类疏水性杂质,GCB 主要用于去除色素类物质,PSA 主要用于去除脂肪酸等物质[25].NANO 作为一种新型碳纳米净化材料,其表面的去活处理,有效降低了对药物分子的吸附性,而其作为传统碳纳米管的官能团修饰产物,又大大增加了对色素、脂肪酸等干扰物的吸附活性,相较于常规SPE 材料,NANO 去除样品色素能力更强,目标分析物的回收率更理想,可广泛用于农产品中农药多残留检测[26].在分析样品制备环节时,考虑到有机酸、叶绿素、脂质和糖类等多种样品共提物可能对目标分析物定量分析造成干扰以及增加分析仪器维护频率,从三种目标分析物在三种蔬菜空白样品中2 mg/kg 的添加水平,考察了QuEChERS 常用C18、NANO、GCB 和PSA 等分散净化材料的不同质量组合对样品共提基质的净化效果,发现适量的C18、PSA 和NANO 对三种目标分析物均无明显吸附,且能达到理想净化效果,而传统的GCB 对目标分析物回收率均有一定影响,故在选用净化剂时,在综合考虑样品净化效果和目标分析物提取效率情况下,以50 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO 作为基质分散净化材料处理样品提取液.

本研究所建立的即食性蔬菜中氯虫苯甲酰胺、甲基硫菌灵和多菌灵残留的QuEChER 前处理程序与常规样品前处理方法相比大幅度降低了有机溶剂消耗,与传统震荡提取法相比显著提高了分析样品制备效率.同时,在UPLC-PDA 分析过程中,采用基质匹配标准曲线定量校准,有效降低了样品基质对残留检测结果的影响.本研究所开发的残留分析方法不仅可为三种即食性蔬菜中三种目标农药的残留检测和监测提供技术支持,还有广泛的应用空间.