lncRNA MEG3靶向miR-130a-5p调控人视网膜色素上皮细胞损伤的研究

曾清雨 汤中 李生富 唐云骢

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种常见的致盲性眼病，其通过影响视网膜的黄斑区域引起老年人严重和永久性视力障碍及失明，发生率较高，且至今无有效治疗方法，极大影响患者生活质量［1-2］。目前研究认为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞功能障碍在AMD发生和进展中发挥关键作用，在外源性刺激或内源性病理变化作用下，氧化应激和炎症反应导致RPE细胞损伤，细胞凋亡增加［3-4］。

多个lncRNA和miRNA已被证实参与调控AMD发生发展，可作为AMD的诊断标志物和治疗靶点［5-6］。其中lncRNA MEG3可通过靶向调控miR-93或miR-34a减轻高糖诱导的人RPE细胞ARPE-19凋亡和炎症反应［7-8］。氧化应激也可诱导人RPE细胞中miR-130a-5p表达上调，提示miR-130a-5p可能参与氧化应激相关的AMD发病机制［9］。此外，研究发现，lncRNA MEG3可靶向调节miR-130a-5p表达［10］。基于此，本研究检测lncRNA MEG3在AMD患者血清中的表达情况，并采用H2O2诱导建立人RPE细胞损伤模型，初步探究lncRNA MEG3对RPE细胞损伤的可能机制，以期为AMD研究以及治疗靶点的选择提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样本来源 选取2020年6月至2021年8月永州职业技术学院附属医院诊治的AMD患者38例（38眼）为研究对象，符合《美国眼科学会年龄相关性黄斑变性临床指南（2019）解读》中的诊断标准［11］，男20例，女18例，年龄50～80岁，平均（62.38±6.82）岁。另选取同期本院健康体检者38例作为对照，无眼部疾病及相关家族史，男21例，女17例，年龄51～80岁，平均（62.59±7.03）岁。本研究均经受试者知情同意并签署知情同意书，且本研究经医院伦理委员会批准（审批号：202005001）。

1.1.2 细胞来源 人RPE细胞系ARPE-19细胞（AC-2141H）来源于美国ATCC公司，使用含10%胎牛血清和双抗（青霉素和链霉素）的DMEM完全培养基重悬，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每两天换液一次，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.1.3 主要试剂 过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）（88597）购自美国Millipore公司；lncRNA MEG3过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA MEG3）和空载体对照（pcDNA3.1-NC）、miR-130a-5p模拟物（miR-130a-5p mimics）和阴性对照（miR-NC）由上海吉玛公司提供；MTT试剂盒（IBO1079G）购自江西艾博因公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（11402ES60）购自上海翌圣公司；RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）试剂盒（RIP-12RXN）购自中国Sigma-aldrich公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（A003-1-2、A001-3-2）购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（EH0201、AQ-H0302-B、FN-EH4494）购自武汉菲恩生物科技有限公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）∕碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（AD10-2）购自日本同仁公司；ROS检测试剂盒（ab113851）及兔抗人核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、β-肌动蛋白（β-actin）、Argonaute2（Ago2）、IgG抗体（ab62352、ab52947、ab8227、ab156870、ab109489）购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RPE细胞损伤模型的构建 将处于对数生长期的ARPE-19细胞接种于96孔培养板（5 000个∕孔），待细胞贴壁后根据苏途等［12］的方法和前期预实验结果添加不同浓度的H2O2（0 μmol∕L、100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L），另设仅添加培养液的孔为调零组，每个处理设置6个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，每孔添加20 μL MTT溶液（5 mg∕mL），孵育4 h后吸去上层培养液，每孔添加150 μL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），使用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度（optical density，OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD值-调零组OD值）∕（对照组OD值-调零组OD值）×100%。选取细胞存活率接近50%的H2O2浓度作为ARPE-19细胞损伤造模浓度。

1.2.2 双荧光素酶报告基因实验 通过ENCORI数据库（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）预测miR-130a-5p可能是lncRNA MEG3的靶点之一。将预测的lncRNA MEG3序列片段和突变片段分别插入到pmirGLO荧光素酶载体中，构建野生型载体（lncRNA MEG3-WT）和突变型载体（lncRNA MEG3-MUT）。采用脂质体法将所构建的lncRNA MEG3-WT、lncRNA MEG3-MUT分别与miR-130a-5p mimic或miR-NC共转染至ARPE-19细胞，转染48 h后进行荧光素酶活性检测，具体操作严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明执行。

1.2.3 RNA结合蛋白免疫沉淀实验 收集转染miR-130a-5p mimic或miR-NC 48 h后的ARPE-19细胞，采用冷PBS洗涤后添加RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）裂解缓冲液裂解。将细胞裂解物与抗Argonaute2（Ago2）抗体（1%）或IgG抗体（1%）偶联的磁珠于4°C下孵育过夜，洗涤磁珠后使用TRIzol试剂提取磁珠结合的RNA，qRT-PCR检测lncRNA MEG3表达水平。

1.2.4 细胞分组与处理 ARPE-19细胞分为对照组（常规培养，不进行任何特殊处理）、H2O2组（200 μmol∕L H2O2处理24 h）、Vector组（转染pcDNA3.1-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2处理24 h）、lncRNA MEG3组（转染pcDNA3.1-lncRNA MEG3 24 h后200 μmol∕L H2O2处理24 h）、lncRNA MEG3+miR-NC组（共转染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-NC 24 h后200 μmol∕L H2O2处理24 h）、lncRNA MEG3+miR-130a-5p组（共转染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-130a-5p mimics 24 h后200 μmol∕L H2O2处理24 h），所用转染方法为脂质体法。

1.2.5 qRT-PCR检测血清和细胞中lncRNA MEG3、miR-130a-5p表达水平 分别收集每位AMD患者和健康体检者清晨空腹静脉血5 mL，离心后收集血清，超低温冰箱保存，备用）。TRIzol试剂提取血清和细胞中总RNA并将其逆转录合成cDNA，然后以cDNA为模板配制qRT-PCR反应体系，于qRT-PCR仪上进行扩增，获取循环阈值（Ct值）。20 μL qRT-PCR反应体系：200 ng∕μL cDNA 2 μL，10 μmol∕L上、下游引物各1 μL（引物序列见表1，由上海吉玛设计并合成），SYBR Green Mix 5 μL，无菌ddH2O 11 μL。反应程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算血清和细胞中lncRNA MEG3相对表达水平（内参基因为GAPDH），以及细胞中miR-130a-5p相对表达水平（内参基因为U6）。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.2.6 MTT法检测细胞活性 将处于对数生长期的ARPE-19细胞接种于96孔培养板（5 000个∕孔），待细胞贴壁后按照1.2.4方法处理细胞，随后参照1.2.1中所述步骤检测各组ARPE-19细胞存活率。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集处理后的各组ARPE-19细胞，PBS洗涤后添加195 μL Annexin VFITC结合液重悬细胞，并依次添加5 μL Annexin VFITC和10 μL PI染色液室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测各组ARPE-19细胞凋亡率。

1.2.8 细胞内氧化应激指标检测 收集处理后的各组ARPE-19细胞，参照ROS检测试剂盒以及MDA、SOD测定试剂盒说明书操作，采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞荧光强度（激发波长485 nm，发射波长538 nm），根据荧光强度计算各组ARPE-19细胞内活性氧（reactive oxygen，ROS）水平（标准化为对照组）；分别采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法、水溶性四唑盐1（water soluble tetrazolium salt 1，WST-1）法测定各组ARPE-19细胞内MDA、SOD水平。

1.2.9 细胞上清液中炎症因子水平检测 收集处理后的各组ARPE-19细胞上清液，参照IL-6、TNF-α、Aβ ELISA试剂盒说明操作，采用ELISA法检测各组ARPE-19细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平。

1.2.10 Western blot检测细胞中Nrf2∕HO-1通路相关蛋白表达 收集处理后的各组ARPE-19细胞，添加裂解液于冰上充分裂解后离心，吸取上清液（即总蛋白），二辛可宁酸法定量蛋白浓度。各样品取20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后将分离的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h后加入兔抗人Nrf2（1：1000）、HO-1（1：2000）、β-actin（1：2000）抗体4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗涤后加入辣根过氧物酶标记的山羊抗兔IgG（1：2000）室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤后电化学发光试剂显色。Image J软件分析各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量（归一化为内参蛋白β-actin）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 25.0进行统计分析。正态分布计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA MEG3表达情况 AMD患者血清lncRNA MEG3表达水平为（0.61±0.16），低于健康体检者（1.01±0.17），差异有统计学意义（t=10.562，P＜0.05）。见图1。

图1 血清lncRNA MEG3表达情况

2.2 RPE细胞存活率及lncRNA MEG3表达情况 与0 μmol∕L比较，100 μmol∕L、200 μmol∕L、400 μmol∕L、600 μmol∕L H2O2处理ARPE-19细胞后，细胞存活率依次降低（P＜0.05），细胞中lncRNA MEG3表达水平亦依次下调（P＜0.05）。见图2。当H2O2处理浓度为200 μmol∕L时，细胞存活率最接近50%。

图2 不同浓度H2O2处理后RPE细胞存活率和lncRNA MEG3表达水平

2.3 lncRNA MEG3与miR-130a-5p关系的验证ENCORI数据库（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）预测显示lncRNA MEG3与miR-130a-5p存在靶向结合位点（图3A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与转染miR-NC比较，同时转染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-WT的细胞相对荧光素酶活性降低（P＜0.05），而同时转染miR-130a-5p mimic和lncRNA MEG3-MUT的细胞相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3B。RIP实验结果显示，与转染miR-NC的细胞比较，转染miR-130a-5p mimic的细胞中Ago2抗体富集更多的lncRNA MEG3（P＜0.05），而转染miR-130a-5p mimic的细胞中IgG抗体富集的lncRNA MEG3差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3C。

图3 lncRNA MEG3与miR-130a-5p的靶向关系

2.4 lncRNA MEG3和miR-130a-5p表达水平比较与对照组比较，H2O2组ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达水平降低，miR-130a-5p表达水平升高（P＜0.05）；与H2O2组、Vector组比较，lncRNA MEG3组ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达水平升高，miR-130a-5p表达水平降低（P＜0.05）；与lncRNA MEG3组、lncRNA MEG3+miR-NC组比较，lncRNA MEG3+miR-130a-5p组ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达水平降低，miR-130a-5p表达水平升高（P＜0.05）；H2O2组和Vector组、lncRNA MEG3组和lncRNA MEG3+miR-NC组ARPE-19细胞中lncRNA MEG3、miR-130a-5p表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组RPE细胞中lncRNA MEG3和miR-130a-5p表达水平比较

2.5 细胞活性和凋亡情况比较 与对照组比较，H2O2组ARPE-19细胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；与H2O2组、Vector组比较，lncRNA MEG3组ARPE-19细胞存活率升高，凋亡率降低（P＜0.05）；与lncRNA MEG3组、lncRNA MEG3+miR-NC组比较，lncRNA MEG3+miR-130a-5p组ARPE-19细胞存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；H2O2组和Vector组、lncRNA MEG3组和lncRNA MEG3+miR-NC组ARPE-19细胞存活率、凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、6。

图5 流式细胞仪检测RPE细胞凋亡

图6 各组RPE细胞存活率和凋亡率比较

2.6 氧化应激情况比较 与对照组比较，H2O2组ARPE-19细胞内ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；与H2O2组、Vector组比较，lncRNA MEG3组ARPE-19细胞内ROS、MDA水平降低，SOD水平升高（P＜0.05）；与lncRNA MEG3组、lncRNA MEG3+miR-NC组比较，lncRNA MEG3+miR-130a-5p组ARPE-19细胞内ROS、MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；H2O2组和Vector组、lncRNA MEG3组和lncRNA MEG3+miR-NC组ARPE-19细胞内ROS、MDA、SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图7。

图7 各组RPE细胞内ROS、MDA、SOD水平比较

2.7 炎症反应情况比较 与对照组比较，H2O2组ARPE-19细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；与H2O2组、Vector组比较，lncRNA MEG3组ARPE-19细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平降低（P＜0.05）；与lncRNA MEG3组、lncRNA MEG3+miR-NC组比较，lncRNA MEG3+miR-130a-5p组ARPE-19细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平升高（P＜0.05）；H2O2组和Vector组、lncRNA MEG3组和lncRNA MEG3+miR-NC组ARPE-19细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图8。

图8 各组RPE细胞上清液中IL-6、TNF-α、Aβ比较

2.8 Nrf2∕HO-1通路相关蛋白表达情况比较 与对照组比较，H2O2组ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与H2O2组、Vector组比较，lncRNA MEG3组ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与lncRNA MEG3组、lncRNA MEG3+miR-NC组比较，lncRNA MEG3+miR-130a-5p组ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；H2O2组和Vector组、lncRNA MEG3组和lncRNA MEG3+miR-NC组ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图9。

图9 各组RPE细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达

3 讨论

随着全球人口老龄化加剧，AMD已成为导致老年群体失明的重要原因之一，为患者和社会带来了沉重的精神和经济负担。因此，确定AMD的潜在治疗靶点、早期规范治疗对于AMD预后改善至关重要。研究表明，lncRNA（如lncRNA TUG1、lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3）可影响RPE细胞功能，调节正常视觉功能，并可能导致视网膜功能障碍［13］。Sun等［14］发现lncRNA MEG3可通过miR-7-5p∕Pax6轴维持RPE分化，从而对AMD发挥保护作用，表明lncRNA MEG3可能是AMD治疗中的一个保护性治疗靶点。本研究结果显示，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表达，提示lncRNA MEG3可能在AMD发生发展中发挥重要作用。

RPE介导的氧化应激广泛参与AMD发病机理和进程，H2O2作为一种强氧化剂，通常在体外实验中用于诱导RPE细胞氧化损伤［15-16］。本研究发现，不同浓度H2O2处理ARPE-19细胞均可降低细胞存活率，且当H2O2处理浓度为200 μmol∕L时，细胞存活率最接近50%，故而后续实验选择200 μmol∕L H2O2处理ARPE-19细胞进行造模。同时，本研究发现，H2O2诱导后细胞存活率、SOD水平降低，而细胞凋亡率及ROS、MDA、IL-6、TNF-α、Aβ水平升高。氧化应激是ROS大量产生和积累的结果，且ROS作用于脂质发生过氧化反应生成MDA，而SOD是抗氧化酶［17］。IL-6、TNF-α是促炎细胞因子，氧化应激可促进RPE细胞分泌更多的IL-6、TNF-α，进而诱导细胞氧化损伤［18］。Aβ亦可作为一种炎症因子，其在眼内大量聚集，可直接损伤RPE细胞，已被证实是AMD发病机制的重要启动因子［19］。以上结果均提示H2O2诱导ARPE-19细胞发生氧化应激和炎症反应，导致细胞损伤。此外，H2O2处理可下调ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达水平，上调lncRNA MEG3可减轻H2O2诱导的ARPE-19细胞损伤，这进一步证实了lncRNA MEG3在RPE细胞损伤中的保护作用［14］。

本研究中，H2O2诱导的ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达下调的同时，发现miR-130a-5p表达水平上调，这与Ayaz等［9］研究结果一致。推测lncRNA MEG3、miR-130a-5p可能通过某种机制参与调控RPE细胞损伤。经ENCORI数据库（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）分析以及双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证，发现人RPE细胞中lncRNA MEG3与miR-130a-5p存在靶向关系。此外，上调H2O2诱导的ARPE-19细胞中lncRNA MEG3表达可降低miR-130a-5p表达，且上调miR-130a-5p表达可部分减弱上调lncRNA MEG3表达对H2O2诱导的ARPE-19细胞损伤的减轻作用。提示上调lncRNA MEG3可靶向负调控miR-130a-5p表达减轻H2O2诱导的人RPE细胞氧化应激和炎症反应，保护RPE细胞免受损伤。

Nrf2∕HO-1通路是重要的抗氧化应激通路，氧化应激状态下，调节氧化还原平衡的关键转录因子Nrf2被活化后与抗氧化反应元件结合，上调下游HO-1等抗氧化因子，提高SOD等抗氧化酶的活性，从而减弱氧化应激和炎症反应，抑制细胞凋亡［20-21］。本研究发现，上调lncRNA MEG3可升高H2O2诱导的ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平，且上调miR-130a-5p表达亦可部分减弱上调lncRNA MEG3表达对H2O2诱导的ARPE-19细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响。提示Nrf2∕HO-1通路参与lncRNA MEG3靶向负调控miR-130a-5p对H2O2诱导的人RPE细胞损伤的保护作用。Luo等［7］研究显示，lncRNA MEG3、Nrf2在高糖处理的人RPE细胞中均降低，lncRNA MEG3通过miR-93∕Nrf2轴抑制高糖诱导的RPE细胞凋亡和炎症。

综上所述，lncRNA MEG3在AMD患者血清中低表达，上调lncRNA MEG3可靶向负调控miR-130a-5p表达，激活Nrf2∕HO-1通路，减轻H2O2诱导的人RPE细胞氧化应激和炎症反应，保护RPE细胞免受损伤。本研究为AMD发病机制研究以及治疗靶点的选择提供了新的思路。但miR-130a-5p是直接还是间接作用于Nrf2∕HO-1通路尚不清楚；此外，miR-130a-5p下游靶基因众多，参与人RPE细胞损伤的lncRNA MEG3∕miR-130a-5p∕mRNA网络仍有待挖掘。