一款刺梨啤酒的研制及其成分检测

黄宝纯 韩雪 王雷 刘宇凡 杨光勇 何光志

传统啤酒是以小麦为原料经发酵制作而成，营养丰富，深受大众喜爱。随着人们生活水平和保健意识的逐渐提高，各种加入了食药物质或中药材提取物的保健型啤酒应运而生，丰富了人们的选择。

刺梨（Rosa Roxburghii Tratt.）被收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版），是贵州省特色资源植物。刺梨作为药食两用植物，具有极高的营养价值和药用价值，被誉为“水果之王”，富含维生素C和黄酮，超氧化物歧化酶（SOD）含量更是居所有水果之首。本研究以刺梨果提取物制备了一款刺梨啤酒，并采用液相色谱-质谱（LC-MS）方法分析其成分，以促进刺梨产品的开发，丰富啤酒种类。

一、材料与仪器

1.主要材料。淡色小麦（德国），啤酒干酵母（烟台曼森商贸有限公司），啤酒花（Hop Breeding Company），刺梨（贵州省黔南州）。

2.主要仪器设备。糖化锅（WS-38，广州伟纳斯不锈钢实业公司），发酵罐（35L，烟台帝伯仕自酿有限公司），糖度计（1.0-1.1，烟台帝伯仕自酿有限公司），高压灭菌锅（YA28X6T，宁波甬安医疗器械制造公司），离心机（Sorvall Legend Micro 21R，美国Thermo Fisher公司），生化培养箱（LRH-150-II，广东医疗器械厂），电子分析天平（EL104，梅特勒-托列多仪器有限公司），电磁炉（WLK-T1，廣东半球实业集团公司），恒温水浴锅（HH-42 （0），苏州威尔实验用品有限公司），离心管（50mL，无锡耐思生物科技有限公司），pH试纸（1-14，杭州富阳特种纸业有限公司），冷冻离心机（H2050-R，湘仪），混匀仪（QL-86，其林贝尔），真空浓缩仪（5305，Eppendorf），滤膜（0.22pm PTFE，津腾），液相色谱仪（ultimate 3000，Thermo），质谱仪（QExactive Focus，Thermo）。

二、实验与方法

1.发酵液制备与前发酵。筛选后的小麦用湿法粉碎，与适量热水（37℃为宜）一起加入糖化锅中蛋白化30min，持续蛋白化升温至65℃使淀粉糖化，时间控制在1h，升温至78℃后保持10min结束糖化。将所得麦汁进行过滤后，放入糖化桶中煮沸1h。第1次加入啤酒花总量的1/10，30min后加入啤酒花总量的1/5，沸腾50min后放入剩余啤酒花。煮沸结束后用冷却管冷却麦汁，使麦汁温度降到20℃为最佳。

称取适量刺梨干粉，加入10倍量68℃左右温水浸泡15min以上，滤得刺梨汁，重复2次，将3次过滤所得刺梨汁汇总备用。干酵母用10倍量的20℃热水进行活化备用。先将刺梨汁和麦汁按0.08：1的比例放入发酵瓶中，边搅拌边添加活化好的酵母，充分混匀后保持通氧5min左右，盖好发酵瓶。将发酵瓶放入生化培养箱中，设置温度为16℃，进行前发酵，发酵时间为7-14d。

2.后发酵。将前发酵好的啤酒进行离心，所得上清液装入已消毒的空啤酒瓶中，封瓶后再次消毒，放入培养箱中进行后发酵，发酵温度为16℃，发酵时间为10-15d，最终得到成品刺梨啤酒。

3.理化指标及感官检测。理化指标采用糖度计检测原麦汁浓度、成品啤酒酒精度，pH试纸检测酸碱度。感官检测则采用人工品尝方法，邀请20名学生，通过肉眼对啤酒外观及泡沫性能进行检测，并品尝啤酒的香气和口味。

4.刺梨啤酒成分的检测。刺梨啤酒成分检测采用LC-MS联用方法。（1）准备检测样本。4℃条件下解冻实验样本，解冻后涡旋1min充分混匀。取样本100?L于2mL离心管中，浓缩干燥后加入400?L甲醇溶液（-20℃保存），振荡1min，混匀。在12000rpm、4℃下离心10min，取全部上清液至新的离心管中，真空浓缩干燥。加入150?L 80%甲醇溶液配置的2-氯-L-苯丙氨酸（4ppm）溶液（-20℃保存）复溶样品，取上清液用0.22?m膜过滤，过滤液加入检测瓶中，用于检测。每个待测样本各取20?L混合成QC样本。

（2）上机检测。①色谱条件。Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific，USA）超高效液相系统，使用色谱柱为ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1×150mm，1.8?m）（Waters，Milford，MA，USA），调节到0.25mL/min的流速、40℃的柱温，进样量取2μL。正离子模式下，流动相为0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脱程序为：0-1min，2%C；1-9min，2%-50%C；9-12min，50%-98%C；12-13.5min，98%C；13.5-14min，98%-2%C；14-20min，2%C。负离子模式下，流动相为乙腈（A）和5mM甲酸铵水（B），梯度洗脱程序为：0-1min，2%A；1-9min，2%-50%A；9-12min，50%-98%A；12-13.5min，98%A；13.5-14min，98%-2%A；14-17min，2%A。

②质谱条件。Thermo Q Exactive Focus质谱检测器（Thermo Fisher Scientific，USA），电喷雾离子源（ESI），正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压3.50kV、负离子喷雾电压-2.50kV，鞘气30arb、辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率70000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 81-1000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压30%、二级分辨率17500，采集信号前3离子进行碎裂，同时采用动态排除法去除无必要的MS/MS信息。

（3）数据处理。通过Proteowizard软件将获得的原始数据转换成mzXmL格式（xcms输入文件格式），再利用R的XCMS程序包进行峰识别、峰过滤和峰对齐，得到包括质荷比（m/z）、保留时间及峰面积等信息的数据矩阵。正离子模式获得15451个前体分子，负离子模式获得11559个前体分子，导出数据至Excel进行后续的分析。

三、结果与分析

1.麦芽汁制备与前发酵。糖化后的麦芽汁呈淡黄色，原麦芽汁浓度为11op，前发酵中，第1天开始出现少量泡沫，至第3天后达最大量，持续8d左右，发酵2周后稍变澄清。离心后得到澄清的淡黄色啤酒液，见图1。

图1：刺梨啤酒前发酵

2.后发酵。后发酵14d，轻晃啤酒有少许起泡，已达啤酒起泡要求，见图2。

图2：刺梨啤酒后发酵

3.理化指标及感官检测。经检测，刺梨啤酒原麦汁浓度为11op，酒精度为3.3% Vol，pH为5-6。感官品评得分见表1。

4.刺梨啤酒成分检测。通过LC-MS方法鉴定出刺梨啤酒中含有543种代谢成分，部分鉴定成分见表2。

四、结论与讨论

现代药理研究表明，刺梨具有抗氧化、降脂、抗动脉粥样硬化、调节免疫、抗癌防癌、排毒、抗衰老、防治糖尿病、保护胃黏膜等作用。经LC-MS方法检测出刺梨啤酒中含有维生素C、槲皮素和山柰素等成分。维生素C是人体必需的水溶性维生素，可提高免疫功能、清除活性自由基、预防癌症、改善脂代谢、缓解因PM2.5造成的肺部炎性损伤。槲皮素是一种类黄酮化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节肠道菌群等作用。山柰素是一种最先从姜科植物山柰中分离得到的黄酮醇类化合物，山柰酚及其糖基化衍生物已被证明具有保护心脏和神经、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗菌等作用，并具有抗癌活性。

将刺梨汁与麦芽汁发酵制成低酒精度的刺梨啤酒，是对刺梨进行深加工的一种新尝试，可以丰富刺梨的用途，提升其价值。

本研究制备的刺梨啤酒是在传统啤酒发酵的基础上添加刺梨提取物，使其具有刺梨发酵风味和发酵产物，同时也具有一定的保健功效。经反复试验，得出该款啤酒的最佳工艺为：刺梨提取液8%、干酵母0.1%、啤酒花1%，经14℃-16℃前發酵7d，后发酵10d得到刺梨啤酒成品，泡沫细腻，挂杯持续3-4min，香气轻微，杀口力强，具有独特的刺梨风味，感官要求及理化指标均符合国家标准。

基金项目：2020年贵州中医药大学药食两用类中药啤酒研究中心。

作者简介：黄宝纯（1999-），男，大学本科，研究方向为制药工程。

*通信作者：何光志（1977-），男，教授、硕士生导师，博士，研究方向为中西医结合。