推拿㨰法对骨骼肌钝挫伤兔MMP-9、TIMP-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表达的影响

阮 磊,黄 博,王兰兰,薛惠天,孙梦龙,段苗苗,彭 亮

(湖南中医药大学,湖南 长沙 410208)

纤维化是骨骼肌损伤后的主要病理特征之一,主要是由细胞外基质(ECM)成分的过度生成和积累所形成。基质金属蛋白酶(MMPs)是众多内源性蛋白水解酶中一类,是许多组织生理和病理过程中ECM成分形成、重塑和降解的关键调节分子。依MMPs结构特征和底物特异性可大致分为5个不同的功能亚型[1],其中明胶酶中MMP-9的主要功能为降解基底膜内的Ⅳ型胶原纤维,并可通过增加炎性细胞的浸润、增强致纤维化因子的作用促进纤维化[2-3]。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是MMPs的重要内源性抑制因子,其中TIMP-1 能与众多MMPs特异性结合,如MMP-9、MMP-1等,从而抑制与之相结合的MMPs活性,进而导致MMPs与TIMP-1的表达量发生变化。当TIMPs与MMPs失衡时,ECM代谢紊乱,胶原沉积,最终形成纤维化[4]。研究发现,转化生长因子-β1(TGF-β1)能够阻碍MMPs的生成,同时促进TIMPs的合成,导致ECM的生成与降解失衡,ECM沉积增加,进一步加剧纤维化[5]。此外,TGF-β1还可通过调控其下游结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)等蛋白表达,直接参与纤维化的形成[6]。推拿㨰法具有行气活血、舒筋活络、缓解痉挛等效应,既往研究发现该法可通过下调TGF-β1表达抑制组织纤维化和减轻炎症反应而促进骨骼肌损伤修复[7]。本实验旨在通过观察推拿㨰法对骨骼肌钝挫伤家兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达的影响,进一步探讨推拿㨰法治疗骨骼肌损伤的可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 15只成年健康普通级新西兰大耳白兔(雌兔7只,雄兔8只),体重2～2.5 kg,由湖南中医药大学动物实验中心采购供应[动物许可证号:SCXK(湘)2020-0005]。实验动物皆由湖南中医药大学动物实验中心依照动物生存适宜湿温环境统一饲养。

1.2主要仪器与试剂 自制重力锤打击装置,㨰法按摩器(授权公开号:CN216365 872U),按摩手法测试仪(上海腾荫教学仪器有限公司,型号:ZTC-II),切片机(浙江金华益迪试验器材,型号:YD-315),电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,型号:MS204TS),脱色摇床(武汉Servicebio,型号:DS-2S100)。HE和Masson染色试剂盒(武汉Servicebio,批号:G1005和G1006),兔源MMP-9一抗、兔源TGF-β1一抗、兔源COL-Ⅰ一抗、鼠源β-actin一抗(武汉Servicebio,批号:GB11132、GB111876、GB114197、GB15001),兔源TIMP-1一抗(武汉三鹰,批号:16644-1-ap),RIPA裂解液(武汉Servicebio,批号:G2002),转膜缓冲液(武汉Servicebio,批号:G2017),脱脂奶粉(武汉Servicebio,批号:G5002),戊巴比妥钠(德国Merck公司,批号:P3761)。

1.3实验方法 将15只家兔完全随机分为空白组、模型组、推拿㨰法组,每组5只。空白组家兔正常喂养,模型组、推拿㨰法组家兔采用自制重力锤打击装置建立骨骼肌钝挫伤模型。造模方法参考文献[7-8]并适当改进:右下肢内侧股四头肌处备皮,将兔仰卧位固定在兔台,在右下肢股四头肌背面与兔台之间放置厚度约1 cm的脱脂棉垫以充分暴露股四头肌平面,击打右下肢内侧股四头肌肌腹(约髌底上3.5 cm)中段。打击时一实验人员将双手置于股四头肌上下端轻度按压固定,以防移位;另一实验人员控制重力锤,将重力锤提至导向管最上端(重力锤最下端与导向管最上端处于同一水平),随后松手让重力锤沿导向管自由落体,连续打击6次,打击面积约为1.77 cm2,动能3.33 J,冲量2.38 N·s;以打击部位肉眼可见红肿、瘀血,且无皮肤破损与骨折,触碰时可见躲避反射为造模成功标准。为保证干预手法操作规范化,在实验操作前,实验人员(同一人)根据专业教材记载的㨰法参数,在 ZTC-II 按摩手法测试仪上测试训练并熟练掌握操作要求和力度。造模成功后第7天开始,对推拿㨰法组兔进行㨰法干预:将兔仰卧位固定于兔台,充分暴露右下肢股四头肌被击打部位,采用课题组自制㨰法按摩器附于肌肉损伤处皮肤实施㨰法,前后滚作用力比为3∶1,最大下压力约3 N,操作频率140次/min,3 min/次,2次/d,连续3 d。空白组、模型组兔同时段捆绑后不做其他处理。

1.4检测指标及方法 干预结束后第3天,采用2%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉,家兔颈动脉放血处死。家兔死后立即取右下肢股四头肌受损组织一小块(约1 cm×1 cm×0.5 cm),于冰板上将肌肉组织切割分离成2等份,其中1份立即放入-80 ℃冰箱保存用于Western blot检测,另1份采用4%多聚甲醛浸泡固定用于HE和Masson染色。

1.4.1骨骼肌病理形态 将用4%多聚甲醛固定24 h以上的组织取出修正,放入对应脱水盒内,将脱水盒放置于脱水机内降梯度浸入酒精内脱水;将组织完全浸入热蜡中包埋,待组织热退成块后修整切片。HE染色:室温下将所制备的切片滴加适量苏木精染液,时间到后取出再将切片放入1%乙醇盐酸溶液中,以达到去除多余苏木精的目的,随后反染5 min。Masson染色:将制备的切片依次使用重铬酸钾、铁苏木素、丽春红浸染,每步时间长度不等,且浸染完成后皆用自来水清洗再进行下一步;随后使用磷钼酸与苯胺蓝染色、醋酸分化,透明封片,阅片软件进行图像采集分析。

1.4.2股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达情况 采用Western blot法检测:使用PBS洗涤股四头肌组织,捣碎后放入匀浆管中,按序依次加入匀浆珠、蛋白酶抑制剂、裂解液等研磨成浆,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集上清液,经过制胶、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育(MMP-9一抗1∶3 000、TIMP-1一抗1∶3 000、TGF-β1一抗1∶3 000、COL-Ⅰ一抗1∶3 000、β-actin一抗1∶2 000,二抗1∶5 000)、显色,检测骨骼肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达量,以β-actin为内参蛋白,检测重复3次,使用AlphaEaseFC处理系统分析目标条带灰度值。

2 结 果

2.1各组兔股四头肌病理形态 HE染色显示:空白组肌细胞大小均匀,排列紧密,边缘清晰,无明显间隙,细胞核因嗜碱性而呈现蓝紫色,且均位于细胞边缘;模型组大量肌细胞变性坏死,大小不一致,炎细胞浸润明显,细胞间隙显著增大,结缔组织显著增多,瘢痕组织形成;推拿㨰法组肌细胞结构相对完整,见少量炎细胞浸润,细胞间隙较小,结缔组织减少。Masson染色显示:空白组肌纤维排列整齐、紧凑,形态结构完整均一,未见明显的蓝色胶原纤维;模型组肌纤维形态多样且不规整,排列紊乱无序,间隙增宽,部分肌纤维融合成片状,边界不清,胶原纤维沉积明显;推拿㨰法组肌纤维结构相对完整,间隙缩小,胶原纤维生成明显减少。见图1及图2。

图1 空白组和骨骼肌钝挫伤各组家兔股四头肌HE染色表现(×100)

2.2各组兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达情况 模型组家兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05),推拿㨰法组家兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图3及表1。

表1 空白组和骨骼肌钝挫伤各组家兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白相对表达量比较

图3 空白组和骨骼肌钝挫伤各组家兔股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白条带图

3 讨 论

随着医疗技术的发展,骨骼肌损伤的治疗手段层出不穷。推拿是传统外治法中应用较多的一种治疗手段,具有便捷、舒适度高、起效快等特性。目前,随着推拿在临床应用范围的不断扩大且治疗效果显著而逐渐被国内外医学工作者所接受和重视。㨰法是中医推拿摆动类手法之一,其受力面积大,作用力均匀柔和且渗透性强,临床使用率高且治疗范围广,被认为是当代最具影响力的推拿手法[9]。

骨骼肌纤维化是一个多因素过程,是不同细胞类型、生长因子、炎症/纤维化细胞因子和蛋白水解酶之间多种细胞和生化事件的整合,进而导致组织微环境发生一系列改变[10]。ECM过度沉积是骨骼肌纤维化的特征性病理改变,其形成主要与骨骼肌组织中MMPs/TIMPs表达失衡相关。COL-Ⅰ是ECM的主要成分,其在细胞内的沉积含量能够直接反映出纤维化程度,与纤维化发展进程呈正相关。降解ECM是MMPs的主要功能,而TIMPs能够反向调控其降解功能,即TIMPs的过表达能够抑制MMPs的活性,使ECM降解受阻,进而导致组织中ECM过度沉积,促使骨骼肌纤维化的发生[11-12]。在正常生理状态下,MMP-9参与ECM的正常代谢,在骨骼肌损伤早期分泌增加以加快ECM的降解;TIMP-1是 MMPs 组织特异性拮抗剂中最为常见且被研究最多的一种,能与MMP-9、MMP-1等特异性结合使其失活从而发挥抑制ECM降解的作用。MMP-9的异常激活能够刺激TIMP-1大量产生而反向抑制其活性,而两者表达水平的失衡致使骨骼肌修复异常。MMP-9持续高水平将会造成纤维坏死、炎症和纤维化等严重后果,并干扰受损肌纤维的再生[13]。有研究发现,抑制MMP-9活性可显著降低mdx小鼠骨骼肌结构破损、炎症、坏死和纤维化的程度,使骨骼肌收缩功能得到明显改善[14-15]。TGF-β1是纤维化的主要诱导因素,与多种组织、器官纤维化的形成密切相关。有研究发现,在杜氏肌营养不良的mdx小鼠动物模型中,TGF-β1蛋白表达显著升高,激活纤维化级联反应,促使成肌细胞向肌成纤维细胞分化,导致骨骼肌再生异常,而给予TGF-β1蛋白抑制剂能显著改善上述变化[16-17]。本课题组前期研究发现推拿㨰法可以减少受损骨骼肌内TGF-β1、GDF-8、F-肌动蛋白等蛋白表达,促进成纤维细胞、肉芽组织及新生血管的生成,降低骨骼肌纤维化程度,提高骨骼肌修复质量[7-8,18]。

本实验结果显示,模型组兔肌纤维形态多样,炎细胞浸润明显,部分肌纤维融合成片状,胶原纤维沉积明显,股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达明显增加;推拿㨰法组肌细胞结构相对完整,炎细胞浸润明显减少,胶原纤维增明显减轻,且股四头肌组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ蛋白表达明显减少。以上结果表明㨰法能通过下调MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅰ的表达,抑制胶原蛋白沉积,调控细胞外基质的生降平衡,进而抑制骨骼肌纤维化,促进骨骼肌损伤修复,这可能是㨰法治疗骨骼肌损伤的作用机制之一。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。