针灸对呼吸机相关肺炎大鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞归巢及胞外诱捕网的影响

李冠胜,张巧梅,施恩明,许 峰,邓扬嘉

(重庆市中医院,重庆 400011)

呼吸机相关肺炎(VAP)是由于呼吸机使用不当或通气时间过长引起的并发症之一,以肺组织毛细血管损伤、肺泡及间质水肿为主要病理表现[1]。在VAP患者中,中性粒细胞在肺泡腔中异常聚集进而形成大量胞外诱捕网是炎症加剧的重要机制[2]。中性粒细胞向外周组织、骨髓、血液循环中定向移动称为中性粒细胞归巢[3];中性粒细胞胞外诱捕网是当机体受到病原微生物入侵时,借助以DNA为主体的纤维丝网来快速、有效地捕获病原体,限制炎症扩散,发挥免疫防御功能的一种网状结构,但其大量形成会加剧局部炎症反应[4-5],故抑制中性粒细胞的归巢,减少其在肺组织中过度聚集形成过多的胞外诱捕网可能控制炎症反应的重要途径。针灸疗法是中医传统外治法,目前国内外学者开展的各类基础和临床研究证实针灸可用于多种疾病尤其是呼吸系统疾病的治疗,其能调控中性粒细胞介导的炎症,能明显抑制肺部炎性反应,减轻肺损害[6-7]。但针灸是否能通过调控中性粒细胞的归巢而抑制胞外诱捕网的过度形成目前尚无定论,故本研究进行了相关探讨。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级成年雄性健康SD大鼠24只,体重300 g左右,购于成都药康生物科技有限公司,动物使用合格证号:SYXK(渝)2019-0002。所有大鼠在无特定病原体的条件下饲养,自由饮水、进食,保持室温21～25 ℃,相对湿度50%～65%,动物房12 h/12 h昼夜交替,适应性喂养1周后进入实验。本实验通过重庆威斯腾生物公司实验动物伦理审查批准(WST.No20220228S0351230)。

1.2主要试剂与仪器 肺炎克雷白杆菌标准株(ATCC700603,重庆市中医院检验科微生物室提供)。水合氯醛(Aladdin,上海);盐酸尼索西汀(MedChemExpress,美国);盐酸普乐沙福(MedChemExpres,美国);CD11b/c Monoclonal Antibody (OX42)(eBioscience,美国 );APC anti-rat CD62L(OX85)(Biolengend,中国);大鼠瓜氨酸组蛋白H3(CITH3)ELISA试剂盒(江莱生物,中国);髓过氧化物酶(MPO)比色法测试盒(伊莱瑞特,武汉);佛波酯(PMA)(Sigma,美国)。一次性毫针、艾条(南阳市汉艾艾制品有限公司);显微外科手术器械包(SSW-3型,上海手术器械厂);小动物呼吸机(DW-3000型,安徽正华生物仪器设备有限公司);共聚焦显微镜(Leica:TCS SP8,德国);流式细胞仪(CytoFLEX Beckman,美国);酶联免疫检测仪 (ThermoFisher,美国);低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);Sytox Green(Thermo Fisher,美国)。

1.3实验方法 将24只大鼠随机分为模型组、针灸组、针灸+归巢抑制剂组、针灸+胞外诱捕网抑制剂组,每组6只。4组大鼠称重后,采用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉,颈部备皮,仰卧位固定,颈部正中切口,钝性分离两侧肌肉暴露气管,注射针刺入气管后以3×1012～3×1013CFU/kg的剂量缓慢注入肺炎克雷白杆菌,注射完毕后竖起大鼠并保持该体位5 min使菌液均匀进入肺组织,完成后逐层缝合肌肉和皮肤。注射菌液后72 h拍摄胸片显示大鼠肺部炎症存在后称重,消毒、分离暴露气管后接小动物呼吸机,呼吸机参数:潮气量12 mL/kg,呼吸频率70次/min,吸入氧浓度100%。为防止体位引起的肺不张,每隔30 min行2～3次大潮气量通气。每天连续通气5 h,持续2 d。通气完成后逐层缝合肌肉和皮肤,拍摄胸片提示肺部炎症较前加重为造模成功。造模成功后30 min,针灸+归巢抑制组给予盐酸普乐沙福溶液2.5 mg/kg腹腔注射,针灸+胞外诱捕网抑制组给予盐酸尼索西汀溶液0.8 μmol/L/290～340 g鞘内注射,然后针灸组、针灸+归巢抑制组、针灸+胞外诱捕网抑制组均给予针灸治疗,即针刺大椎、肺俞、风门,平补平泻手法,每10 min行针1次,留针30 min;于针刺治疗结束后将点燃的艾条,距相同穴位皮肤表面2 cm处实施温和灸,施灸15 min。针灸干预均2次/d,连续3 d。模型组不进行任何治疗干预。

1.4检测指标及方法

1.4.1支气管肺泡灌洗液中胞外诱捕网形成情况实验结束后处死大鼠,剪开胸腔,取右肺组织,用4 ℃生理盐水10 mL行支气管肺泡灌洗5次,每次灌洗量>5 mL,回收量>90%,收集支气管肺泡灌洗液。取部分灌洗液,用缓冲液洗涤后接种于培养孔板爬片中,加入PMA使其终浓度为300 ng/mL,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养3 h,孵育结束后加入Sytox Green和Hochest混合染色液37 ℃染色5～10 min,室温固定10 min,清洗,封片,激光共聚焦观察。

1.4.2支气管肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量严格按照CITH3和MPO试剂盒说明书步骤和要求进行操作。

1.4.3支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞归巢比例取支气管肺泡灌洗液洗涤后调整细胞浓度制成样本悬液;分别取2 μL CD11b/c-PE 和CD62L-APC流式抗体加入不同流式检测管中,然后分别加入100μL样本悬液至检测管中混匀,室温避光孵育20min,加入500μL红细胞裂解液,37℃裂解5 min;裂解后加入完全培养基终止裂解,1 000 r/min离心3 min,清洗2次,用缓冲液重悬后上机检测。

1.5统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行数据统计处理,计量资料正态分布检验采用 Komlogorov-Smirnov Normality,符合正态分布,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用非参数检验的Kruskal-Wallis检验。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肺泡灌洗液中胞外诱捕网形成情况 针灸组、针灸+归巢抑制组、针灸+胞外诱捕网抑制组的胞外诱捕网数量均较模型组少,且针灸+归巢抑制组、针灸+胞外诱捕网抑制组的胞外诱捕网数量较针灸组少。见图1。

2.2肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量 针灸组、针灸+归巢抑制组、针灸+胞外诱捕网抑制组的CITH3和MPO含量均明显低于模型组(P均<0.05),且针灸+归巢抑制组、针灸+胞外诱捕网抑制组均明显低于针灸组(P均<0.05)。见图2。

2.3肺泡灌洗液中中性粒细胞归巢比例 针灸组和针灸+归巢抑制组中性粒细胞归巢比例明显低于模型组和针灸+胞外诱捕网抑制组(P均<0.05),且针灸+归巢抑制组明显低于针灸组(P<0.05),模型组和针灸+胞外诱捕网抑制组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 呼吸机相关肺炎各组大鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞归巢比例

3 讨 论

针灸具有调和阴阳、扶正祛邪、疏通经络的作用,且操作简便易行、经济安全,逐渐受到全世界的重视和认可,已经成为国际上使用最为广泛的传统医学,应用于全球193个国家和地区,并逐步被纳入主流医学体系[8]。研究发现,针刺肺俞穴可改善呼吸系统疾病患者的肺通气量[9];电针百会、大椎穴可减少卒中相关性肺炎大鼠炎症细胞浸润,减轻肺间质水肿,促进肺功能恢复[10]。说明针灸对肺炎具有积极的治疗作用,但其具体作用机制尚不明确。

胞外诱捕网是一种新型的中性粒细胞抗菌方式,其借助于以DNA为主体的纤维丝网状结构来快速、有效的捕获病原体,限制炎症扩散[11]。既往研究发现,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰中检测到的胞外DNA与体外诱导中性粒细胞产生的胞外诱捕网结构相似,证实胞外诱捕网参与了COPD慢性气道炎症的病理生理过程[12-13]。在重症肺炎病情发展过程中,胞外诱捕网会将病原菌束缚在病灶局部,但同时也引起局部过度的炎症反应,其引发的损伤常导致患者病情恶化[14]。因此,胞外诱捕网在肺炎的发生发展和调控中具有重要作用。另外中性粒细胞与淋巴细胞有类似的归巢途径,中性粒细胞在肺泡腔中异常聚集可导致炎症加剧[15]。有研究发现CXCR4抑制剂可调控中性粒细胞从炎症组织中释放,进而促进血液循环中中性粒细胞的再分布[16]。在小鼠哮喘模型中,发现针灸能有效减少小鼠白细胞总数、中性粒细胞计数,可减少炎症因子分泌,抑制气道炎症反应[17]。但针灸对中性粒细胞归巢和胞外诱捕网形成是否有影响尚不明确。

本实验通过构建VAP大鼠模型,采用激光共聚焦观察支气管肺泡灌洗液中胞外诱捕网数量和客观量化支气管肺泡灌洗液中CITH3、MPO含量(CITH3和MPO是胞外诱捕网中镶嵌的蛋白或酶)及中性粒细胞归巢比例,证实针灸可减少胞外诱捕网的过度形成,可抑制中性粒细胞的归巢。初步得出针灸或许可通过抑制VAP大鼠支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞归巢而减少胞外诱捕网的形成,进而达到治疗VAP的作用。但本研究存在以下不足:①大鼠造模成功与否很难量化衡量;支气管肺泡灌洗液留取过程极易受到操作者和外界环境的影响,针灸治疗易受到操作者的主观行为影响,均可造成实验结果的误差。②本研究的标本较单一,缺乏其他标本的检测数据支持。③本实验仅处于基础研究阶段,对患者是否有相同影响尚不明确,有待深入研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。