基于“脾主运化”理论探讨芪药鸡金粥通过PI3K/Akt/NF-κB通路防治化疗致胃肠黏膜损伤的机制

翁美华,邓丽金,胡静温,3,周红娟,陈锦秀,陈焰南

(1. 福建中医药大学,福建 福州 350122;2. 厦门大学附属中山医院,福建 厦门 361000;3. 四川大学华西医院,四川 成都 610000)

化疗致胃肠道黏膜炎(Chemotherapy-induced Gastrointestinal Mucositis,CIGIM)又称化疗致胃肠道黏膜损伤,是许多化疗药物的剂量限制性不良反应之一,病理学上以胃肠上皮细胞凋亡为特征[1-2]。据报道,在接受标准剂量化疗后,大约40%的患者和100%接受骨髓或干细胞移植高剂量化疗的患者会出现CIGIM[3-4]。CIGIM及其相关并发症可导致化疗剂量减少,影响癌症患者总体生存率,增加了患者医疗负担,降低患者生活质量。中医学认为脾胃气虚、脾失健运是CIGIM的基本病机,纠正脾胃气虚以健运脾胃,恢复脾主运化功能是CIGIM防治的重要途径。脾主运化是指脾将饮食水谷消化成精微物质与糟粕,并将精微物质吸收转输到全身各脏腑的生理功能,包括运化水谷和运化水液两个方面。芪药鸡金粥具有益气健脾功效,临床应用发现可减轻化疗后胃肠道反应[5]。动物实验研究证实,芪药鸡金粥可上调肠道紧密连接蛋白表达,保护肠道机械屏障的结构与功能,从而改善CIGIM,其作用机制可能与活化细胞外信号调控激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、抑制脊髓 Toll 样受体 4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路下游的关键蛋白IκBα降解有关,但未找到芪药鸡金粥经TLR4通路抑制IκBα降解的证据[6-7]。既往研究表明,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/NF-κB信号通路是调控肠黏膜炎症的关键通路,是健运脾胃的重要作用靶点[8-9]。因此,本研究以“脾主运化”作为理论基础,以CIGIM脾气虚大鼠为研究对象,基于PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨了芪药鸡金粥调控CIGIM肠道紧密连接蛋白表达的机制,以进一步明确芪药鸡金粥的作用机制,为其临床防治CIGIM提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级雄性Wistar大鼠48只,8周龄,体重(200±20)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,实验动物合格证号:SCXK (沪) 2018-0006。大鼠饲料为福建中医药大学实验动物中心统一配制,单笼喂养,自由饮食,环境温度20～26 ℃,相对湿度40%～70%,每天人工光源12 h明暗交替。

1.2药膳及药品 芪药鸡金粥(黄芪20 g、淮山20 g、莱菔子10 g、鸡内金10 g、粳米50 g),其中黄芪产自山西,淮山产自河南,鸡内金、莱菔子和粳米产地不限,所有药膳原材料均购自福建中医药大学国医堂中药房。氟尿嘧啶注射液(5-FU,上海旭东海普药业有限公司,国药准字H31020593)。

1.3主要试剂 封闭蛋白-1(Claudin-1)兔多克隆抗体、闭锁蛋白(Occludin)兔多克隆抗体、闭锁小带蛋白(ZO-1)兔多克隆抗体、结合黏附分子-1(JAM-1)兔多克隆抗体(福州沃森生物公司,货号分别为28674-1-AP、27260-1-AP、21773-1-AP、ET1610-90),Anti PI3K p85鼠单克隆抗体、Akt鼠单克隆抗体、NF-κB 兔多克隆抗体、Phospho-PI3K p85多克隆抗体、Akt-phospho-S473鼠单克隆抗体(福州沃森生物公司,货号分别为60225-1-Ig、60203-2-Ig、14220-1-AP、PA5-104853、66444-1-Ig),动物细胞总蛋白抽提试剂(碧云天,P0013B),BCA蛋白定量试剂盒(碧云天,P0012A),ECL增强型化学发光底物检测试剂盒(Santacrzu,SC-2048),SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天,B1007)。

1.4主要仪器 温控摇床(New Brunswich USA),电子天平BS124S(德国赛多利斯公司),恒温水槽DKB-501A型(上海精宏设备有限公司),-80 ℃超低温冰箱(美国 Thermo Fisher Scientific 公司),移液枪(Eppendorf公司,法国),微量加样吸头(Rainin,美国),4 ℃低温冰箱(青岛海尔),制冰机(AF10 SCOTSMAN,美国),去离子水仪(PALL, Purelab Plus,美国),PVDF膜(Millipore,美国),超高灵敏化学发光成像系统、电泳仪、凝胶玻璃板、固定夹、垂直电泳槽、转移槽(美国 Bio-Rad 公司),通用显影粉、酸性定影粉(天津天陆海感光材料厂),转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司),高速离心机、低温离心机(Eppendorf,德国)。

1.5药膳及白粥制作方法 依据《中国药膳制作及从业资质基本要求》标准(编号ZGYS/T001-2010),参照《中医药膳学》[10]制作。芪药鸡金粥制作方法:放入药材后加水600 mL,浸泡30 min,武火煎煮10 min,取汁,加入粳米,煮熟后滤液、浓缩(每毫升药液含生药1.25 g),4 ℃储存。白粥制作方法:淘洗过的粳米50 g加水600 mL,武火煎煮10 min,改用文火熬至汤汁浓稠,煮熟后滤液、浓缩,4 ℃储存。

1.6实验方法 大鼠常规适应性喂养7 d后,采用随机数字表法完全随机分为空白组、模型组、药膳组,每组16只,采用5%苦味酸及0.5%中性品红溶液标记动物。 药膳组于实验第1天9:00—10:00开始给予芪药鸡金粥灌胃(复温至37 ℃),模型组及空白组给予白粥灌胃,均1次/d,每次10 mL/(kg·d)(参照人鼠体表面积换算灌胃剂量,人按照60 kg计算[11]),连续14 d。灌胃方法:将大鼠固定于左手,头颈保持平直,右手持装有药膳或白粥滤液的注射器,将针头沿大鼠左侧口角,徐缓经口腔插入约5 cm,将药液徐徐推注进胃内。实验第7天,各组灌胃30 min后,药膳组和模型组大鼠给予5-FU 150 mg/kg一次性腹腔注射[12],空白组给予等量生理盐水注射。实验第8天(化疗后第1天),3组各随机抽取8只大鼠,禁食24 h后处死,其余大鼠继续灌胃。实验第15天(化疗后第8天),剩余大鼠经禁食24 h后处死。

1.7检测指标及方法

1.7.1回肠组织病理形态 大鼠禁食禁水24 h后,脱颈椎法处死,打开腹腔,解剖取出小肠,使用生理盐水将小肠内容物冲洗干净后,于距回盲部约5 cm处剪取回肠3 cm,生理盐水冲洗干净后,立即置于4%多聚甲醛固定24 h,常规制备石蜡切片,HE染色,光镜下观察。

1.7.2回肠组织中紧密连接相关蛋白和PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取-80 ℃冻存的回肠组织,用等量的蛋白样本(50 μg)进行SDS-PAGE凝胶电泳,湿法转膜,在5%脱脂奶粉封闭液中封闭(4 ℃,过夜),弃去封闭液。加入封闭液稀释好的Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1、PI3K、Akt、IκBα、p-Akt、p-PI3K蛋白抗体及GAPDH抗体(1∶1 000),TBST漂洗滤膜4次,每次10 min。将膜与辣根过氧化酶标记的二抗(1∶5 000)室温下摇荡孵育2 h,然后用TBST充分洗膜,漂洗4次,每次10 min。显影液置膜上,凝胶成像仪成像,测定各条带的灰度值, 目的蛋白的灰度值与β-actin的比值代表目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠回肠组织病理形态 实验第15天,空白组大鼠回肠黏膜绒毛结构完整,未出现充血、水肿、剥脱和炎性细胞浸润现象,上皮细胞连接紧密,腺体形状规则;模型组大鼠回肠黏膜绒毛变性、萎缩,部分绒毛脱落,完整性受破坏,有大量炎性细胞浸润,腺体被破坏;药膳组与模型组相比,回肠黏膜绒毛结构相对完整,绒毛脱落现象有所恢复,炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 空白组和化疗各组大鼠实验第15天回肠组织病理形态(HE染色)

2.2各组大鼠回肠组织中紧密连接蛋白表达情况实验第8天和第15天,模型组和药膳组大鼠回肠组织中Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相对表达量均明显低于同期空白组(P均<0.05),但药膳组Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见图2、图3及表1。

表1 空白组和化疗各组大鼠回肠组织中紧密连接蛋白相对表达量比较

图2 空白组和化疗各组大鼠实验第8天回肠组织中紧密连接蛋白表达情况

图3 空白组和化疗各组大鼠实验第15天回肠组织中紧密连接蛋白表达情况

2.3各组大鼠回肠组织中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达情况 实验第8天和第15天,模型组和药膳组大鼠回肠组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相对表达量均明显低于同期空白组(P均<0.05),但药膳组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见图4、图5及表2、表3。

表2 空白组和化疗各组大鼠实验第8天回肠组织中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白相对表达量比较

表3 空白组和化疗各组大鼠实验第15天回肠组织中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白相对表达量比较

图4 空白组和化疗各组大鼠实验第8天回肠组织中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达情况

图5 空白组和化疗各组大鼠实验第15天回肠组织中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达情况

3 讨 论

化疗药物属热毒之邪,在对抗癌瘤的同时,容易耗伤人体气血、灼津耗液,使机体气血俱损,伤及脾胃,从而导致脾胃气虚失之健运。本研究所用芪药鸡金粥是益气健脾经典药膳,记载于唐代医家昝殷《食医心鉴》,其组成中黄芪为补气诸药之最,性微温味甘,入脾、肺经,有益气健中、补养脾胃之气功效,可增强机体免疫功能;淮山性味甘平,入脾、肺、肾经,具有健脾益胃、滋肾益精等作用,辅助黄芪以补脾胃之气;鸡内金、莱菔子助脾胃之健运,防黄芪、淮山之壅滞,共奏益气健脾、消食导滞之效,使药膳补而不滞,补中寓通;粳米性平、味甘淡,具有健脾胃、补中气之效。芪药鸡金粥切中CIGIM的病因以及脾胃气虚失之健运的病机。

肠道屏障由机械、免疫、生物和化学四大屏障构成,其中机械屏障为肠道屏障最重要的组成部分,主要由肠黏膜上皮细胞、上皮细胞间紧密连接和菌膜三部分组成[13]。机械屏障完整可以有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入组织。当肠黏膜受到化疗药物的刺激时,其紧密连接结构会被破坏,损伤肠道屏障功能,导致肠道内各种抗原激活黏膜固有层的免疫系统,启动过度持续的免疫炎症反应,造成肠黏膜损伤[9]。紧密连接蛋白是肠道屏障功能的重要组成部分,PI3K/Akt/NF-κB通路在调控紧密连接蛋白合成过程中发挥重要作用[14]。在PI3K/Akt/NF-κB信号通路中,PI3K参与紧密连接的形成过程,促进骨架蛋白重排,p-PI3K可与ZO-1和Occludin的C端结合,影响紧密连接的闭合;活化的NF-κB启动基因转录与炎症反应,使紧密连接蛋白分布异常和表达下降,增加肠道的通透性,破坏肠道黏膜屏障,进而加重肠道损伤[15-16]。本实验结果显示,实验第15天模型组大鼠回肠黏膜绒毛变性、萎缩,部分绒毛脱落,完整性受破坏,有大量炎性细胞浸润,腺体被破坏;药膳组回肠黏膜绒毛结构相对完整,绒毛脱落现象有所恢复,炎性细胞浸润减少。实验第8天和实验第15天模型组回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相对表达量均明显低于空白组,药膳组各蛋白相对表达量也降低,但下降程度明显轻于模型组。 这说明化疗药物5-FU能显著影响大鼠肠黏膜紧密连接蛋白的表达,破坏肠道机械屏障防护功能,芪药鸡金粥可在一定程度上通过上调肠道机械屏障紧密连接蛋白的表达而缓解回肠黏膜损伤。

研究显示,PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与了胃肠黏膜损伤的发生发展,对其进行调控是修复胃肠黏膜的关键[14-15]。PI3K是一系列胞内传导酶家族,Akt则是一种与蛋白激酶C相关的丝氨酸或苏氨酸激酶,是PI3K下游的直接作用靶点。当所有位点被磷酸化,细胞膜上的Akt就被完全激活,被激活的Akt从细胞膜释放进入细胞浆或细胞核中进行信号的传输,执行其生物学功能。因此,Akt的磷酸化可被作为判断PI3K活性的指标。NF-κB由活化的PI3K/Akt激活,能够起到多向性的调节作用,可调节免疫炎症相关的多种细胞的基因表达。研究显示,在正常状态下,NF-κB与其抑制分子IκBα结合存在于细胞质中,当细胞受到外界信号(如化疗药物、脂多糖等)刺激时,通路上的Akt被活化,p-Akt可促使下游IκBα发生磷酸化而与NF-κB解离,此时NF-κB被激活而移位进入细胞核内,与DNA上相应位点结合发挥生物学效应,加重炎症反应[17-18]。本实验结果显示,实验第8天和第15天模型组和药膳组大鼠回肠组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相对表达量均低于空白组,但药膳组各通路蛋白下降的程度轻于模型组。这说明当肠黏膜受到化疗药物刺激时,PI3K/Akt/NF-κB信号通路被激活,使通路蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα表达降低,而益气健脾芪药鸡金粥能够一定程度上抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活,减轻炎症反应,从而减轻肠道黏膜损伤。

综上所述,芪药鸡金粥可以调节肠道紧密连接蛋白表达,减轻化疗后胃肠黏膜损伤,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号传导阻断NF-κB信号级联激活,抑制炎症细胞因子介导有关。但药膳复方成分复杂,可能作用于疾病相关的不同靶点,是否对PI3K/Akt/NF-κB 信号通路具有特异性抑制作用尚不完全确定,有待进一步研究,从而为益气健脾药膳改善化疗后胃肠黏膜损伤提供更系统、明确的分子理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。