基于网络药理学探讨桃核承气汤治疗脓毒症的潜在分子机制

吴科锐,刘云涛,华艳朗,许 健,王大伟

(1. 广州中医药大学第二附属医院,广东 广州 510000;2. 广州中医药大学,广东 广州 510000;3. 广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510000)

脓毒症(sepsis)是指宿主对感染的反应失调导致危及生命的器官功能障碍综合征[1],具有高致死率、高致残率等特点,据统计其住院病死率为14.7%～30%[2-3]。由于病理机制复杂,给脓毒症的临床救治带来诸多困难,成为重症监护病房患者死亡的主要原因之一[4]。中医药在脓毒症临床救治中受到一定关注。桃核承气汤出自《伤寒论》,具有解毒逐瘀之效,是脓毒症临证治疗中常用的方剂之一。研究显示,桃核承气汤有助于控制脓毒症患者感染、凝血紊乱,对降低病死率有一定的作用[5],在常规治疗基础上联合桃核承气汤,可降低脓毒症患者血清炎症因子水平,抑制炎症反应[6]。动物实验研究亦发现,桃核承气汤可能通过减少CD4 mRNA和TLR4 mRNA的表达,进而下调TNF-α、IL-6等炎症因子的表达,减轻脓毒症大鼠小肠组织炎性损伤[7]。然而,目前对桃核承气汤治疗脓毒症分子机制的研究仍处于初步探索阶段,尚缺乏深入发掘。本研究拟立足于脓毒症的生物信息学相关数据,应用网络药理学的研究方法,对桃核承气汤治疗脓毒征潜在的分子机制进行挖掘,为进一步阐明桃核承汤治疗脓毒症的药理机制提供参考,为进一步挖掘桃核承气汤的药用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1桃核承气汤活性成分及作用靶标预测 检索中药系统药理学分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.pp)[8]、中医百全书数据库(ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)[9]获取桂枝、桃仁、大黄、甘草的活性成分及其对应的作用靶标。检索TCMSP数据库时,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及类药性(drug likeness,DL)≥0.18为标准筛选中药的活性成分。检索ETCM数据库时,仅纳入类药性分级为中等及以上的活性成分。由于以上数据库未收录芒硝,故通过检索中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)[10]、中医药综合数据库(TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)[11]补充获取芒硝的化学成分及其作用靶标。通过STRING11.0数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)[12]及Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)[13]将靶标蛋白名转化成对应的基因符号。

1.2脓毒症相关靶标预测 以“sepsis”为检索词,检索Gene Expression Omnibus数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[14],获取GSE11755、GSE48080、GSE57065三个基因表达谱。以P.value<0.05,|log2(Fold Change)|>2为筛选标准,通过GEO 2R插件分析筛选出脓毒症与正常对照组的差异表达基因。检索DisGenet数据库(https://www.disgenet.org/)[15]及GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)[16]获取脓毒症相关疾病基因。将以上获得的基因整合去重后,确定为脓毒症的相关靶标基因。

1.3中药-活性成分-潜在靶标网络构建 筛选桃核承气汤作用靶标与脓毒症相关靶标的共同靶标,确定为桃核承气汤治疗脓毒症的潜在靶标。筛选出潜在靶标对应的活性分子及中药,应用Cytoscape3.8.2软件(https://cytoscape.org/)[17]构建中药-活性成分-潜在靶标网络。

1.4蛋白质-蛋白质互作(Protein Protein Interaction,PPI)网络构建 通过STRING11.0数据库构建潜在靶标的PPI网络,设置互作分数≥0.4,隐藏游离靶标。将结果导入Cytoscape3.8.2软件,对网络进行拓扑分析,筛选网络中的关键节点。

1.5基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析 将关键靶标输入Metascape(https://metascape.org/)[18]数据库,进行GO功能分析,包含生物过程、细胞组分、分子功能三个方面。设置Min Overlap为3,P.Value Cutoff为0.01,Min Enrichment为1.5,对富集条目进行聚类。利用SangerBox数据分析平台(http://sangerbox.com/)对富集分析结果进行可视化。

1.6京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 通过Cytoscape 3.8.2软件的ClueGO和CluePedia插件进行关键靶标的KEGG通路富集分析,以P.value<0.01为阈值筛选富集的通路并进行聚类分析,初步了解桃核承气汤治疗脓毒症可能的信号通路。

2 结 果

2.1药物活性成分及作用靶标的预测结果 通过检索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM、TCMID数据库,共获得桂枝相关活性成分9个,大黄相关活性成分33个,桃仁相关活性成分24个,甘草相关活性成分115个,芒硝相关活性成分2个,整合去除相同的活性成分后,共得到桃核承气汤相关的药物活性成分169个。整合四个数据库获得的药物活性成分作用靶标,最终共获得桃核承气汤相关活性成分作用靶标391个。

2.2脓毒症相关靶标预测结果 整合GSE11755、GSE48080、GSE57065三个基因序列差异表达分析的结果,去除重复后共得到差异表达基因474个。检索GeneCards、DisGenet数据库分别获得脓毒症相关疾病基因2 622个、1 453个。整合以上3个数据库获得的基因,去除重复后共获得脓毒症相关靶标基因3 525个。

2.3中药-活性成分-潜在靶标网络构建结果 获取中药活性成分相关靶标基因与脓毒症相关靶标基因的交集,共得到238个共同基因,见图1。238个潜在靶标基因中,35个与桂枝8个活性成分相关联,107个与大黄24个活性成分相关联,45个与桃仁15个活性成分相关联,214个与甘草97个活性成分相关联,8个与芒硝2个活性成分相关联。分别将对应的中药、活性成分及潜在靶标导入Cytoscape 3.8.2软件构建网络,结果见图2～5,菱形节点代表中药,箭形节点代表药物活性成分,椭圆形节点代表靶标。活性成分节点的颜色越深代表其作用的潜在靶标越多。大黄的活性成分中,作用靶标最多的前3位分别为山柰酚(Kaempferol)、(-)-儿茶素((-)-catechin)和β-谷甾醇(beta-sitosterol),其作用靶标分别有69个、24个和21个。甘草的活性成分中,作用靶标最多的前3位分别为槲皮素(quercetin)、山柰酚(Kaempferol)和芒柄花素(formononetin),其作用靶标分别有122个、69个和35个。桂枝的活性成分中,作用靶标最多的前3位分别为β-谷甾醇(beta-sitosterol)、紫杉叶素(taxifolin)和儿茶素((+)-catechin),其作用靶标分别有21个、10个、8个。桃仁的活性成分中,作用靶标最多的前3位分别为β-谷甾醇(beta-sitosterol)、儿茶素(Catechin)和常春藤素(hederagenin),其作用靶标分别有21个、19个和7个。芒硝两个活性成分为硫酸镁(magnesium sulfate)和12H2O硫酸钠(Na2SO4·10H2O),前者有6个潜在作用靶标,而后者有2个潜在作用靶标。

图2 大黄-活性成分-潜在靶标网络

图3 甘草-活性成分-潜在靶标网络

图5 桃仁-活性成分-潜在靶标网络

图6 芒硝-活性成分-潜在靶标网络

2.4PPI网络构建结果 将238个潜在靶标基因输入STRING11.0数据库,选择物种为智人,构建PPI网络。将网络导入Cytoscape 3.8.2软件,对网络进行分析后,以连接度(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)作为网络关键节点筛选指标,筛选出连接度大于网络节点连接度2倍中位数,且介度大于网络节点介度中位数、紧密度大于网络节点紧密度中位数的所有节点。最终共筛选得到58个关键节点。这些节点在网络中起着关键作用,故可能是桃核承气汤治疗脓毒症的潜在关键靶标。将58个关键节点对应的靶标基因再次输入String数据库,以相同的方法构建PPI网络,将结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化,结果见图7,网络由58个节点,1 091条边构成,节点平均degree为37.6。节点的degree越大,则该节点越大,颜色越深。蛋白与蛋白之间的互作分数越大,则节点之间连线越粗,颜色越深。其中,节点degree排名前5的蛋白分别为MAPK3(degree-=53)、AKT1(degree-=52)、MAPK1(degree-=52)、JUN(degree-=51)、IL6(degree-=51)、STAT3(degree-=50)、TP53(degree-=50)、EGFR(degree-=50)、MYC(degree-=50)、RELA(degree-=49)、TNF(degree-=49)、VEGFA(degree-=49),推测这些靶标蛋白可能是桃核承气汤治疗脓毒症关键靶标中的重要部分。

图7 关键靶标的PPI网络

2.5GO富集分析结果 58个关键靶标基因输入Metascape数据库,进行GO富集分析及GO条目的聚类分析。在生物过程方面,获取了前20个聚类,对每个聚类中P.value最小的条目进行展示,见图8。20个GO条目分别是DNA结合转录因子活性的调节、对脂多糖的反应、炎症反应、白细胞分化、细胞对脂质的反应、细胞迁移的正调控、凋亡信号通路、肽基丝氨酸磷酸化、细胞黏附的调节、肽基酪氨酸磷酸化、细胞蛋白质定位的调节、对生长因子的反应、活性氧代谢过程的正调控、细胞分化的负调控、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、对活性氧的反应、神经元死亡、对肽的反应、脂质定位的调节、水解酶活性的正调控。在分子功能方面,获取了前20个聚类,对每个聚类中P.value最小的条目进行展示,见图9。20个GO条目分别是DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、激酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合、蛋白激酶活性、核心启动子序列特异性DNA结合、核受体活性、抑制转录因子结合、一氧化氮合酶调节活性、激素受体结合、激活转录因子结合、MAP激酶活性、整合素结合、蛋白酶结合、蛋白质同二聚化活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、组蛋白脱乙酰酶结合、蛋白激酶C活性、支架蛋白结合。在细胞组分方面,获取了前14个聚类,对每个聚类中P.value最小的条目进行展示,见图10。14个GO条目分别是膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、受体复合物、细胞质核周区、富含ficolin-1的颗粒、核膜、髓鞘、主轴、早期内体、谷氨酸能突触、PML体、核基质、内质网腔。

图8 潜在靶标的GO生物过程富集分析

图9 潜在靶标的GO分子功能富集分析

2.6KEGG通路富集分析结果 通过Cytoscape3.8.2软件的ClueGO和CluePedia插件进行58个关键靶标的KEGG通路富集分析,结果聚类得到11个类别,见图11。每个类别中P.value最小的通路分别为IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)、丙肝(Hepatitis C)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、乙肝(Hepatitis B)、GnRH信号通(GnRH signaling pathway)、百日咳(Pertussis)、阿米巴病(Amoebiasis)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)及幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)。

图11 关键靶标的KEGG通路富集分析

3 讨 论

“热、毒、瘀、腑实、虚”是脓毒症发生发展过程中的重要病理因素[19],以活血通腑法为代表的桃核承气汤在脓毒症的临床救治中使用,取得了一定的疗效[20-21]。为初步认识其治疗脓毒症的活性成分,潜在靶点及可能的分子机制,本研究通过网络药理学方法进行了分析。结果显示,桃核承气汤可能通过多个活性成分,作用于多个靶标,调节多个信号通路而发挥治疗脓毒症的作用。

在药物成分上,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分具有广泛的作用靶点,可能在桃核承气汤抗脓毒症中发挥重要的作用。槲皮素、山柰酚、芒柄花素、紫杉叶素都属于黄酮类成分。黄酮类化合物具有一定的抗炎、抗氧化活性[22]。既往研究发现,山柰酚可降低脓毒症小鼠肺组织及血浆中的细胞因子IL-6、IL-1β和 TNF-α的表达,可能通过抑制氧化应激等作用减弱小鼠脓毒症诱导的急性肺损伤[23-24]。在脓毒症动物模型中,槲皮素可通过抑制IL-6等促炎因子的释放发挥一定的抗炎作用[25],可能通过激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/通路抑制心肌组织中TNF-α、IL -6等炎症因子的表达,从而降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)脓毒症小鼠心肌组织炎症和氧化应激反应,减轻心肌损伤[26]。β-谷甾醇、儿茶素在脂多糖(LPS)诱导炎症反应模型中均显示出相应的抗炎作用。儿茶素的干预可显著抑制炎症模型中一氧化氮合酶 (iNOS)、环氧合酶(COX-2)、JunN 末端激酶 (JNK) 的表达,降低IL-6、TNF-α的mRNA的水平,可能通过抑制 JNK 和 NF-κB 调节途径而发挥抗炎活性[27]。β-谷甾醇可阻止炎症因子(TNF-α、IL-6)的释放,下调NF-κB信号转导通路的活化,从而减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤及炎症反应[28]。

通过对作用靶标PPI网络进行分析,最终共筛选得到桃核承气汤治疗脓毒症可能的关键靶标58个,其中MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等作用靶标可能是桃核承气汤治疗脓毒症关键靶标中的重要部分。通过文献研究发现,这些靶蛋白主要参与炎症反应、细胞凋亡、免疫调节及血管屏障构建等。MAPK3、MAPK1均属于丝裂原活化蛋白激酶家族的成员,MAPK家族广泛参与脓毒症各阶段的病理过程,与炎症因子释放、内皮细胞活化、白细胞迁移及免疫细胞凋亡密切相关,其对抗炎与促炎的复杂调控可能对脓毒症过程中炎症反应失衡具有重要意义,其参与介导内皮细胞活化是脓毒症患者血流动力学紊乱,组织灌注不足的机制之一[29]。STAT3是信号转导与转录激活子的亚基之一,RELA编码转录因子 p65,这是转录因子家族nuclear factor κB(NF-κB) 的一个亚单位,而NF-κB是真核生物炎症反应的关键调控蛋白。IL-6、TNF是脓毒症发生发展过程中关键的炎症因子,当机体发生感染时,位于单核细胞或巨噬细胞细胞膜或细胞器膜表面的模式识别受体通过识别病原体相关的分子模式,从而激活随后的信号通路,如NF-κB、Janus/STAT等,从而介导IL-6、TNF等炎症介质的产生[30-31]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,而PI3K/AKT信号通路的激活可以有效抑制细胞凋亡及炎症反应,从而增强宿主对脓毒症的抵抗力[32]。JUN基因编码转录因子AP-1。研究发现,脓毒症期间AP-1调节CD4+CD25+Tregs细胞中的转录因子 Foxp3启动子活性,从而介导Foxp3在Tregs细胞中高表达,Foxp3的稳态及高表达对Tregs细胞分化、发育等过程至关重要,而脓毒症期间Tregs细胞对细胞活化的有效调节又是脓毒症免疫抑制的关键因素[33]。EGFR是人表皮生长因子受体之一,在炎症反应中,EGFR磷酸化能激活下游MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路,最终激活NF-κB等转录因子,促进IL-1、IL-8等炎症因子的释放[34]。研究表明,在脓毒症期间,EGFR可能通过促进炎症因子的产生及细胞凋亡介导相关的肾损伤[35]。MYC基因编码转录因子BHLH。在脓毒症细胞模型中,IL-6、TNF-α的表达升高,而在MYC基因沉默的脓毒症模型中,两者的表达降低,且细胞的增殖受抑制。研究表明,MYC可能通过抑制细胞凋亡和诱导细胞增殖参与LPS诱导的脓毒症过程,并可能降低LPS诱导的脓毒症炎症反应[36]。VEGFA属于配体-酪氨酸激酶受体系统,在脉管系统中广泛表达,参与正常血管屏障的构建。在脓毒症期间,VEGFA表达升高,导致血管内皮屏障破坏和组织炎症,血管渗漏和血容量不足、组织水肿、微循环流量改变,最终导致MODS[37]。

对关键靶标的GO富集分析结果显示,桃核承气汤可能通过影响转录因子活性调节、对脂多糖反应、炎症反应、细胞分化、细胞凋亡等生物学过程,调节转录因子结合、细胞因子受体结合、酶的结合、酶的活性等分子功能而发挥抗脓毒症效应,其作用位点主要位于膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、受体复合物、细胞质核周区等细胞组分上。进一步对作用通路进行分析发现,IL-17信号通路、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、HIF-1信号通路等可能是桃核承气汤治疗脓毒症的关键通路。这些信号通路与炎症反应、细胞凋亡、免疫调节等机制密切相关。脓毒症时,IL-17信号通路相关基因紊乱表达,进而促进炎症反应[38]。在肺炎诱导的脓毒症中,IL-17信号通路被激活,进而促进了细胞焦亡[39]。肠功能障碍是脓毒症常见的并发症,研究表明,脓毒症期间小肠的运动障碍与小肠固有肌层内 IL-17信号传导的激活相关,靶向IL-17A可以部分挽救小肠的活力,减轻脓毒症期间Cajal (ICC)间质细胞的损伤[40]。NOD样受体和C型凝集素受体是模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)家族两大主要成员,前者属于细胞质PRRs,后者属于膜结合PRRs。脓毒症期间,NOD样受体、C型凝集素受体通过识别入侵人体的病原微生物,进而激活下游NF-κB、MAPK等信号转导通路,导致炎症因子及趋化因子的产生与释放,介导相应的炎症反应[41-42]。Th17细胞与Treg细胞均由CD4+细胞分化而成,前者可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子而介导炎症反应,后者可分泌IL-10等抑炎因子而发挥免疫抑制作用,Treg/Th17细胞平衡维持着机体的免疫稳态,而脓毒症免疫紊乱及多器官功能障碍的发生与Treg/Th17细胞失衡密切相关[43]。缺氧诱导因子(HIF)是维持氧稳态重要的转录因子,由含有α和β亚基的异源二聚体组成,在哺乳动物中共发现了HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三个亚基。研究发现,HIF参与了脓毒症的过度免疫与免疫耐受[44],在脓毒症晚期,单核细胞通过HIF-1α信号通路而发挥免疫抑制效应[45]。

综上,桃核承气汤可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分,作用于MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL-6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等靶标蛋白,调节IL-17、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、HIF-1信号通路等,进而影响炎症反应、细胞凋亡、免疫调节及血管屏障构建等生物学过程而发挥治疗脓毒症的作用。然而,本研究仅是基于生物信息学的数据对桃核承气汤治疗脓毒症的可能分子机制进行初步挖掘与预测,仍有待后期通过动物实验、细胞实验等对本研究结果进行进一步验证,以更好阐明桃核承气汤治疗脓毒症的机制,为进一步开发桃核承气汤治疗脓毒症的价值奠定基础。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。