KIAA0319基因与汉族儿童阅读障碍的关联性研究△

赵华 刘瑞芳 姚水洪 左彭湘

学龄前期和学龄期是儿童语言发育和认知发展的关键时期,而阅读能力是此期儿童必须具备的能力。儿童发展性阅读障碍(developmental dyslexia,DD)是一种先天性神经发育障碍,这类儿童具有正常的智力和完好的感知力,享有均等的教育机会和相同的社会文化背景,同时在听觉、视觉和神经系统方面无明显的器质损伤,但阅读成绩明显落后于同龄儿童水平,处于困难状态[1]。不同的语系和人群背景,DD的阳性筛查率并不一致,从3.0%到20.0%不等[2,3]。阅读能力丧失会直接影响儿童对知识的获取,严重影响其自尊心、同伴关系和师生关系。现代医学认为DD是一种病因复杂的多基因遗传性疾病,遗传因素是导致DD的重要因素,大量研究[4-6]指出位于6号染色体上的KIAA0319是DD的候选基因,但不同的研究结果差异较大。鉴于此,本研究聚焦基因KIAA0319中被反复提及的单核苷酸多态性位点(single-nucleotide polymorphisms,SNPs),以浙江省衢州市的汉语DD儿童为研究对象,明确KIAA0319基因多态性和儿童DD的关联性,为高风险儿童的基因筛查和干预提供理论依据。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 采用整群抽样的方法,抽取浙江省衢州市2～6年级学生3 061名进行调查,其中男生1 565名(51.13%),女生1 496名(48.87%)。所有参与调查的儿童均有监护人签署知情同意书,本研究得到学校伦理委员会审批。DD儿童的纳入标准为:①《儿童学习障碍筛查量表》[7]总分低于65分;②学习成绩排在班级后10%;③《儿童汉语阅读障碍量表》[8]得分高于平均分2个标准差以上;④《中国韦氏儿童智力量表》[9]智力测验得分≥80分;⑤无视觉、听觉、知觉障碍和神经系统病变。本研究共筛选出DD儿童168名,阳性率为5.49%(168/3 061)。其中男102例,女66例,年龄8～12岁,平均9.54±1.36岁。从研究群体中选取168名无阅读障碍的儿童作为对照组,DD组和对照组儿童在性别、年级、年龄、智商等方面差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组儿童临床资料

1.2研究方法

1.2.1SNPs选择 基于本课题组前期进行的Meta分析及在其他群体中的相关研究[5,10-12],本研究共纳入基因KIAA0319的4个SNPs位点:rs4504469、rs3212236、rs6935076、rs3756821。在HapMap中的基因变异资料,4个位点在汉族群体中最小等位基因频率MAF≥0.05,r2≥0.8(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.2样本采集 获得儿童及其监护人的知情同意,用一次性口腔黏膜拭子采集口腔黏膜脱落细胞:①采集前清水漱口1次;②用采样拭子在儿童口腔两侧的颊黏膜处轻刮2～3次;③将采集到脱落细胞的拭子头端浸入到盛有保存液的EP管中;④分门别类保存备用。

1.2.3DNA提取 从脱落细胞中提取基因组DNA:①在PCR管中加入300 μL的细胞裂解液,并将口腔黏膜拭子一并加入PCR管中;②水浴65℃,30 min后,加入蛋白酶,混匀后继续水浴55℃,3 h;③加入蛋白沉淀剂涡旋振荡20 s,继续-20℃下冰浴5 min;④多次高速离心后,弃掉上清液,加入100 μL DNA水解酶,室温下轻微震荡12 h,短暂离心后转移至储存管。并用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度[5]。

1.2.4基因分型 本试验按前期研究中[5]方法采用多重SNP 分型试剂盒进行SNP分型,根据选择的4个SNP合成特异引物并优化连接反应体系后组装而成。为控制质量,对随机选择的4% DNA质量高的样本进行重复分析,每个SNP的存活率均在98%以上。

2 结果

2.1SNPs基本信息 基因KIAA0319的4个SNPs位点的基本信息见表2(https://regulome.stanford.edu/regulome-search),位点rs4504469和rs3212236的Regulome DB得分为5分,位点rs6935076和rs3756821的Regulome DB得分为4分,具有较高的研究价值。所有位点的基因型在对照组儿童中的分布均符合HWE(P>0.05),说明该研究选取样本具有群体代表性。

表2 KIAA0319基因SNPs基本信息

2.2单个位点的等位基因频率与阅读障碍发生风险分析 对纳入研究的4个SNPs位点进行等位基因频率分析,显示位点rs6935076(OR=1.660,95%CI:1.174～2.348,P=0.004)、位点rs3756821(OR=0.590,95%CI:0.426～0.817,P=0.001)、位点rs3212236(OR=1.468,95%CI:1.077～2.000,P=0.015)在病例组和对照组之间的差异有统计学意义。对4个SNPs位点的等位基因频率进行Bonferroni校正检验,显示位点rs6935076(P=0.023)和位点rs3756821(P=0.015)与阅读障碍仍有显著关联(表3)。

表3 单个位点等位基因频率与阅读障碍的关联性分析

2.3单个位点的基因型频率与阅读障碍发生风险分析 对纳入研究的4个SNPs位点进行基因型频率分析,结果显示与位点rs6935076的基因型TT相比,此位点的基因型CC可显著增加阅读障碍的发病风险(OR=1.941,95%CI:1.232～3.057,P=0.004);与位点rs3756821的基因型TT相比,此位点的基因型CC可显著降低阅读障碍的发病风险(OR=0.321,95%CI:0.147～0.705,P=0.005);与位点rs3212236的基因型CC相比,rs3212236的基因型TT可显著提升阅读障碍的发病风险(OR=2.065,95%CI:1.106～3.858,P=0.023)。对4个SNPs位点进行Bonferroni校正检验,显示rs3756821与阅读障碍仍有显著关联(P=0.010)(表4)。

2.4单倍体关联性分析 对基因KIAA0319的rs4504469、rs6935076、rs3756821、rs3212236四个位点进行LD分析,结果显示四个位点的|D′|均≥0.7(表5)。使用Haploview软件进行基因单倍型分析,四个位点形成1个单倍域,即Block1(Three-SNPs Haplotype:rs6935076-rs3756821-rs3212236),共有4种单倍体,频率均大于0.05,其中单倍体CCC在所有单倍体中频率最高,占全部样本的40.6%,见图1。用χ2检验进一步分析各单倍体与阅读障碍的关联性,显示单倍体CCC和TTT在两组之间的差异有统计学意义(P<0.05),见表6。

图1 KIAA0319基因SNPs连锁不平衡的单倍域图|D′|值

表5 KIAA0319基因SNPs的连锁不平衡分析结果

表6 KIAA0319基因SNPs组成的单倍体与DD的关系

3 讨论

Cope等[13]对6号染色体进行研究,发现了rs4504469与DD的相关性,证实了KIAA0319是DD的易感候选基因。此后相关研究层出不穷,但主要是集中在欧洲等英语语系的研究[14,15],有学者[8,10,11,16]专注汉语DD的研究,有学者[1,5,12]在新疆维吾尔族儿童中也进行维语语系的相关研究。大量研究均证实DD是遗传因素、环境因素和其他相关因素共同作用的结果,并且遗传因素占据主导作用[17]。但由于研究样本大小不一致、研究语系的差异、研究方法的区别,关于DD候选基因KIAA0319的多态性研究结论并不一致,在维语语系和英语语系的研究结论并不一定适用于汉语语系。

本研究纳入的KIAA0319基因的4个SNPs位点选择主要依据Meta分析及在其他群体中的相关研究。Zou等[10]对欧洲人群的5项独立研究实施Meta分析,发现位点rs4504469与DD的发生存在关联。Shao等[11]纳入10项研究,进行候选基因KIAA0319与DD关联性分层Meta分析,揭示位点rs4504469在欧洲群体和亚洲群体中的作用正好相反。此外, Deng等[12]纳入11项研究进行系统评价,指出rs4504469、rs6935076、rs32122363个位点与阅读障碍相关。而rs3756821在位置上与rs6935076、rs32122363位点接近,有研究[5]证实rs3756821是中国维吾尔族儿童DD障碍的易感位点,且与上述两个位点构成的单倍域也与DD的发生密切相关。

本研究对KIAA0319基因的4个SNPs位点进行遗传多态性研究,发现KIAA0319基因rs6935076、rs3756821、rs3212236位点与DD存在相关性。rs3212236位点位于基因KIAA0319 5＇末端上游区域,Harold等[18]对英国牛津的264个家系样本进行研究,发现rs3212236与阅读障碍中的表型正字法的选择存在高度相关性,后续研究[19]证实rs3212236的突变基因可以改变基因的表达,进而导致阅读障碍。rs6935076位点位于基因KIAA0319的内含子1上,研究者[20]推断rs6935076可以调节基因的表达,编码的异常蛋白会导致左侧大脑颞顶区域的白质合成减少,降低儿童的阅读能力。rs3756821位点位于基因KIAA0319的5′非翻译区,不直接改变基因的表达,但对基因表达的调控作用会影响脑皮质发育过程中神经元的迁移及轴突的生长,导致不同脑区之间的错误连接[16]。

本研究使用Haploview软件进行基因单倍型分析,显示四个位点的|D′|均≥0.7,为连锁不平衡。且rs6935076、rs3756821、rs3212236三个位点形成1个单倍域,进一步分析发现单倍体CCC和TTT与阅读障碍的发生密切相关。LD是衡量等位基因在不同位点间相关性的指标,是多位点关联检验的媒介,一般认为,同一基因内的多个位点联合分析比单一位点分析结果更精确;但也有研究[21]指出如果构成单倍域的位点突变过多,会产生错误的遗传效应。实际上,构成单倍域的位点组合有多种形式,而携带风险位点更多的单倍体更容易导致阅读障碍。

通过发现风险位点和单倍体,本研究证实KIAA0319是汉族儿童阅读障碍的遗传易感基因,揭示了DD的分子机制,为儿童DD早期预测、早期识别提供了实验依据,并为其他类似多基因遗传性疾病的研究提供思路。但本研究只限于若干有争议的位点,具有相对局限性,后续会进一步扩大基因和位点的选择,争取为阅读障碍的研究提供更强有力证据。此外,本研究团队会继续探讨基因和基因的交互作用,以及基因和环境之间的交互作用与DD的关联性,并且会在机制研究的基础上,实施DD的干预和治疗分析。