玉米单倍体育性自然恢复研究进展

杨继伟，曲彦志，崔丽洋，毛熙岚，刘宗华，李浩川

(河南农业大学 农学院/河南粮食作物协同创新中心,河南 郑州 450002)

玉米单倍体只含有1套染色体组，在减数分裂过程中不能形成正常的配子，因而表现出高度不育，无法直接利用，只有通过染色体成功加倍，产生所有等位基因纯合、正常可育的(DH)系后，才能用于玉米育种。近年来，由于单倍体育种逐步彰显其独特的优势，该技术的相关研究越来越深入，从诱导基因的克隆和诱导机制的发现[1-2]，到新型高频率孤雌生殖诱导系的选育[3-4]及高效自动化单倍体分选仪的成功研制[5]，使单倍体产生和鉴定效率得到了大幅度提高，极大地推动了该技术的规模化应用。然而，单倍体不能高效地成功加倍已是单倍体育种技术工程化应用的瓶颈。目前，化学药剂处理是单倍体加倍的主要方法，但该方法费时费工，加倍过程也比较繁琐，所利用的化学药剂常常对人体和环境造成较大的危害[6]。所以，实现玉米单倍体育种规模化和工程化，需要探索高效、简便、快捷的单倍体加倍途径。为此，对单倍体育性自然恢复的表现和影响因素以及育性自然恢复的有关机制进行了综述，以期为玉米单倍体育种提供借鉴。

1　玉米单倍体育性表现

1.1　玉米单倍体雄穗自然恢复

单倍体植株在生长发育过程中能正常抽雄，由于只含有1套染色体组，表现高度不育，即使单倍体中的10条染色体在减数分裂过程中同时进入一个细胞，产生可育配子的概率也只有1/512，但在育种实践过程中发现,不同遗传背景的单倍体存在着不同程度的育性恢复，有的单倍体仅仅有一个或者几个小穗能够散粉，有的是一个或者几个分支，也有少数的单倍体整个雄穗都可以散粉，这可能与单倍体细胞二倍化的早晚和程度有关，为单倍体的自然加倍提供了可能性[7]。Khoklov等[8]报道了单倍体在没有经过化学处理或者物理因素影响下，二倍体细胞存在单倍体植株的任何部位组织，最多的组织细胞中二倍体细胞比例达到1.23%，并认为这是自然加倍的结果。可见，自然状态下单倍体体细胞也具有一定的二倍化倾向。Chase[9]、魏俊杰等[10]分别对单倍体雄穗自然恢复进行了研究，结果表明,自然恢复率在10%左右，不同基因型之间差异显著，变异系数达50%。也有研究表明,有的单倍体材料不具有自然二倍化的能力[11]。Shatskaya等[12]研究认为,单倍体雄穗的可育性程度是遗传性状，基因型来源不同的单倍体雄穗育性恢复能力差异很大，并在4个不同来源的单倍体材料发现雄穗育性恢复率具有显著性的差异。

1.2　玉米单倍体雌穗自然恢复

Chalyk[7]利用来自10个马齿型玉米的234个单倍体植株，并与混合的正常二倍体的花粉进行杂交授粉，其中仅有8个果穗未结实，结实最多的果穗可达到127粒，平均每个果穗结实26.6个籽粒。Geiger等[13]利用3个单倍体群体采取开放式和二倍体植株花粉授粉的方法观察单倍体雌穗结实特性，发现最高单倍体结实数要超出平均每穗的结实粒数的3～6倍，其中第一个群体平均结实25～192粒。魏俊杰等[10]、刘志增等[14]研究结果也都表明，单倍体雌穗育性自然恢复率都达到90%以上。任姣姣[15]利用郑单958的花粉对不同来源的22个自交系的单倍体的雌穗进行多次重复授粉，分析单倍体雌穗育性的恢复能力，结果表明，单倍体雌穗平均结实株率为89.54%，平均结实籽粒数为15.4个。由此可见，单倍体雌穗自然恢复为二倍化的能力远远高于雄穗，因此，单倍体雌穗育性自然恢复能力不是限制单倍体自然加倍的主要因素。

2　玉米单倍体自然恢复影响因素

2.1　母本遗传背景的影响

单倍体自然加倍能力受母本材料基因型控制，研究结果表明，不同来源材料的单倍体，雄花自然恢复率不足5%，有的材料甚至不具有自然加倍的能力[11-12]。Chalyk[7]研究表明，单倍体雄穗育性自然恢复在不同单倍体材料间也存在显著差异，不同基因型的自然加倍效率大约在0%～21.4%。许洛等[16]对5个来自国外血缘不同杂交种的单倍体进行自然恢复研究，结果表明，单倍体育性差异显著，最高散粉率为13.8%，最低仅为0.57%，先玉808、MSD1和DMY1为自然加倍效果较好的材料。Shatskaya等[12]对613/2C4、Mol7、Ts8、Tsl6的单倍体进行研究，4个不同材料的单倍体雄穗育性自然恢复率分别是21.9%、1.2%、5.3%、3.4%。Kleiber等[17]在对早熟和温带2种不同玉米种质资源的单倍体自然加倍率的研究中，发现早熟种质来源的单倍体育性恢复效率高于晚熟品种，对于温带种质类型的材料，单倍体来源于骨干种质的散粉率及结实率比来源地方种质的高。

2.2　生态环境的影响

单倍体的生长环境对其自然恢复效率也有极大的影响。Kleiber等[17]在大田和温室2种不同环境中利用当地玉米资源和热带玉米种质资源的单倍体对其育性恢复效率进行统计分析，结果表明，在温室条件下单倍体的平均恢复率要远高于大田单倍体的自然恢复率。许洛等[16]利用5份不同基因型材料的单倍体在石家庄春播和夏播以及海南冬播3个环境条件下对其单倍体自然加倍的效果进行研究发现，不同基因型材料间，不同生态环境下加倍效果差异显著，海南冬播效果最好，其次为石家庄春播。段民孝等[18]和蔡泉等[19]也证明了甘肃和海南两地的单倍体的自然加倍效率显著高于黄淮海地区和东北地区。甘肃和海南单倍体自然加倍之所以效果较好，可能是因为两地区整体气温相对比较稳定，尤其是在植株生殖器官从生长到成熟阶段，不会经受较高的温度，而且昼夜温差比较大，有利于单倍体生殖生长的发育。刘志增等[14]的研究也表明在单倍体生长前期昼夜温差的变化与单倍体雄穗育性恢复有显著的相关趋势。由此可见，选择合适的种植环境，可以提高单倍体的育性恢复效率。

2.3　播期的影响

单倍体自然加倍还与播种时间有一定的关系，尤其在同一个区域内，不同播种时间对单倍体育性恢复有显著的差异。王文洁等[20]在河南新乡利用同一个材料的单倍体探索了10个不同播期对单倍体自然加倍的影响，结果表明，不同的播期对单倍体加倍率有明显差异，在该地区4月27日至5月2日有利于单倍体自然加倍，加倍率在57%左右。刘德友等[21]在山东青岛研究了不同基因型不同播期对玉米单倍体自然加倍的影响，结果表明，不同基因型单倍体自然散粉率差异很大，自然散粉率为6.56%～65.33%；夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交结实率为6.23%～9.39%，比春播高2.37%；夏播更有利于单倍体自然散粉和自交结实。段民孝等[22]在华北地区研究19个玉米单倍体在春、夏播不同播种期对自然加倍率的影响，结果表明，该地区春播时期更利于玉米单倍体的自然加倍。单倍体育性自然恢复受环境影响较大。由于我国地域广阔，不同地区的气候环境相差很大，导致不同地区的最佳播种时期不一致，所以在选择正确的播种地点的同时，也要考虑播种日期对单倍体自然加倍的影响，方可达到更好的加倍效果。

2.4　其他因素的影响

单倍体育性恢复不仅受到基因型和环境的影响而且还受到其他因素的影响。有研究表明，经过单倍体加倍成功的DH系，再进行诱导获得的单倍体自然恢复率高达40%以上[23]，这可能是由于控制单倍体育性恢复的基因一直存在，导致单倍体自然加倍率较高。由于单倍体植株矮小，生长势相对较低，尤其是进行生殖发育过程中，土壤营养、田间湿度以及光照时间和强度都将会影响到单倍体雄穗是否自然产生可育的花粉和结实率，由此可见，单倍体自然加倍受多种因素影响，因此，实现单倍体加倍基地化和专业化，提高单倍体加倍效率，是单倍体育种工程化的一项重要内容。

3　玉米单倍体育性自然恢复的细胞学机制

利用秋水仙素(Cochicine)[17,24-25]、APM(Amiprophosmethyl)[26]、氨磺乐灵(Oryzalin)[27]和氟乐灵(Trifluralin)[28]等化学药剂进行单倍体化学加倍，取得了显著的效果，普遍认为其加倍机制是这些化学药剂降解了微管蛋白，抑制了纺锤丝的形成[29]，而纺锤丝在体细胞有丝分裂过程中和生殖细胞减数过程中期起着重要的作用，这种纺锤丝的异常现象会造成正常的2个姐妹染色单体或同源染色体不能正常移向细胞两极，从而引起单倍体细胞染色体加倍。但这些化学药剂处理浓度过高、时间过长不仅加重药害，还会产生畸形和多倍体现象；反之，处理浓度过低、时间太短则达不到预期加倍的效果，因此，合适的药剂浓度和处理时间至关重要。

截至目前，玉米单倍体自然恢复的生物机制一直不清楚，但是几乎所有的单倍体植株都存在自发二倍化的现象。Gayen 等[30]通过观察单倍体花粉母细胞认为，单倍体能够产生可育的花粉，这与细胞融合有关。Testillano等[31]对玉米小孢子进行培养，通过显微镜观察发现，在培养到5～7 d发现有多核细胞存在的现象，提出了早期细胞核的融合是导致单倍体加倍的主要原因。吴鹏昊等[32]利用流式细胞仪对郑单958诱导产生的单倍体在自然条件下的二倍化现象进行观察发现，体细胞加倍与生殖细胞加倍并不显著相关，而雌雄穗加倍存在差异，并且雌穗自然加倍率较高。目前关于单倍体染色体自然加倍有很多假说，比如核内复制、核内有丝分裂、花粉管中营养核和精子融合等，均可能导致自然加倍发生[33]。

4　玉米单倍体育性的遗传机制

玉米单倍体育性自然恢复主要体现在雄穗和雌穗2个方面，早期对于单倍体雄穗和雌穗育性恢复没有过多的研究，目前研究结果表明，单倍体育性自然恢复是由核基因所控制。吴鹏昊[34]对多个不同杂种优势类群的自交系和杂交种的单倍体进行雄穗育性恢复研究发现，该性状在不同遗传背景的材料中表现出显著的差异，并利用2个育性自然恢复能力较强的材料与恢复能力较低的材料进行正反交，对得到的F1的单倍体育性自然恢复进行比较分析，发现单倍体都具有恢复能力，并没有显著性差异，由此可见，单倍体育性自然恢复性状不受细胞质基因的影响；又利用郑单958 F2:3群体的单倍体，通过多年综合试验，定位到了控制单倍体雄穗育性自然恢复的基因位点，共检测到8个有关的QTL位点，其中8号染色体上在不同年份间检测到了一个共同的QTL位点。Ren等[35]利用2个单倍体雄穗育性恢复差异明显的材料组配了F2:3单倍体群体，并通过多年多点试验，对不同家系的单倍体雄穗育性观察统计，结合分子数据进行QTL分析，共发现4个相关的QTL位点，其中3个QTL位点均在单倍体群体中检测到，同时检测到了1个位于第6染色体的主效QTL，介于IND166和IND1668两个标记之间。此外，河南农业大学也利用分离群体在郑州和海南2个不同的环境下对单倍体雄穗自然恢复进行QTL分析，检测到了3个共同的QTL与该性状相关。随着研究的不断深入，控制单倍体雄穗自然恢复的基因将被克隆，为提高单倍体自然恢复能力提供更强的理论支撑。

5　展望

玉米单倍体育种技术已与转基因技术、分子标记辅助选择技术一起成为现代玉米育种三大核心技术[36]，高效的玉米单倍体育种技术体系，将会大大提升我国的玉米育种水平，加速突破性品种的培育，提升种子企业的市场竞争力。单倍体加倍作为单倍体育种技术体系的关键环节，尤其是自然加倍，由于具有简便、快捷的优势，更会引起高度重视，可以围绕以下几个方面开展工作：(1)加强单倍体自然加倍分子机制的研究，开发出功能标记，用于实践中，实现单倍体自然加倍的高效化；(2)探索出不同来源基因型与加倍环境的互作效应，找出最适合单倍体自然加倍的区域，实现单倍体自然加倍的基地化；(3)根据自然加倍的特点，培训一批技术人员，熟练掌握基地管理、自然加倍的识别、自交授粉等技术，实现自然加倍操作的专业化。随着研究的不断深入，研制出高效的玉米单倍体自然加倍技术，不仅可以确保人员和环境的安全，还可以减少其他加倍方法繁琐的过程，节省人力物力，节约育种成本，并将加速玉米单倍体工程化育种进程。