单倍体胚胎干细胞研究概述

黄宇航 陈伶莉 胡雪峰

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

单倍体胚胎干细胞(haploid embryonic stem cells， haESCs)是指只含有一套染色体，但具有类似于正常干细胞分裂与分化能力的细胞群。根据诱发方式不同，单倍体胚胎干细胞主要分为两类： 孤雌单倍体胚胎干细胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cells， PG-haESCs)和孤雄单倍体胚胎干细胞(androgenetic haploid embryonic stem cells， AG-haESCs)。近年来，单倍体胚胎干细胞研究领域取得了一系列突破性成果。本文对单倍体胚胎干细胞的研究进展进行概述。

1 单倍体胚胎干细胞及其研究意义

哺乳动物的所有体细胞正常情况下均为二倍体，分别来自父方和母方，当外界因素影响导致基因突变时，二倍体的基因组可减小突变带来的不利影响；双亲两套染色体的选择性表达，使后代表现型呈现出多样性，有利于个体进化。然而，不同于二倍体细胞，单倍体细胞只有一套染色体，这大大降低了基因组的复杂程度，使其成为遗传学和基因组学研究的重要工具。在哺乳动物体内，有两类细胞处于单倍体状态，它们分别是减数分裂后的生殖细胞和某些癌细胞。生殖细胞功能高度特化，且难以在体外进行长期培养、扩增，也很难对其进行基因操作与筛选。从癌细胞中分离出的接近单倍体的异倍体细胞系虽然能够稳定培养，但此类细胞系的非整倍体性限制了其在基因研究及疾病治疗方面的应用。

近年来，随着小鼠单倍体胚胎干细胞系的成功建立，单倍体胚胎干细胞的基因功能研究已经从细胞水平提升到了机体水平。尽管如此，单倍体细胞自发二倍化[1]、哺乳动物基因印记状态的维持[1～4]、实验动物遗传背景的选择[3]以及物种差异的影响，都给单倍体胚胎干细胞系的建立与进一步的研究带来了巨大的挑战。

2 单倍体胚胎干细胞系的建立

植物单倍体的研究始于1972年，Gupta和Carlson首次建立了烟草单倍体细胞系。之后，单倍体细胞系在不同种类的高等植物中陆续建立。然而，动物单倍体细胞系的建立则显得困难重重。2009年，Yi等[5]成功建立青鳝鱼稳定的单倍体胚胎干细胞系，并将该单倍体胚胎干细胞的细胞核移植到正常未受精的卵细胞中，通过生殖系嵌合得到半克隆后代。这里所提到的半克隆后代指的是由一方单倍体源性基因和另一方单倍体源性基因相互结合形成的、拥有正常染色体数的、胚胎发育成的后代。哺乳动物单倍体胚胎干细胞在培养过程中会出现自发的二倍体化现象，再加上受单倍体细胞分离技术的制约，哺乳动物单倍体胚胎干细胞系的建立直到2011年才有所突破[6，7]，这一成果将单倍体胚胎干细胞的研究推向新的高度。

2.1 孤雌单倍体胚胎干细胞系的建立 建立孤雌单倍体胚胎干细胞系的关键在于未受精的卵母细胞如何在体外被“激活”产生“干细胞特性”。研究发现，可以通过物理(电脉冲)和化学方法(乙醇、细胞松弛素、离子霉素等)或两种方法的交互应用模拟受精时卵母细胞内的钙震荡，从而实现未受精卵母细胞的激活并完成减数分裂，获得孤雌囊胚。随后，用化学免疫法去除孤雌囊胚的滋养层得到内细胞，将其接种在以γ射线或丝裂霉素C处理的饲养层上，用干细胞培养液培养[6，7]。传代过程中，将干细胞团块用消化酶打散成单个细胞后染色，并定期分选富集，从而最终建立起孤雌单倍体胚胎干细胞系。

2011年，英国科学家Leeb与Wutz[6]和奥地利科学家Elling等[7]采用流式细胞分选技术，成功地从小鼠孤雌发育的单倍体胚胎中建立了小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞系。如今，单倍体胚胎干细胞的研究已经推广到人类。2016年，Sagi等[8]成功建立了拥有干细胞典型特征的人单倍体胚胎干细胞系。Zhong等[9]也通过显微操作去除人受精卵中的雄原核的方法，建立了孤雌胚胎，高效得到了两个人单倍体胚胎干细胞系。

2.2 孤雄单倍体胚胎干细胞系的建立 孤雄单倍体胚胎干细胞的获得较复杂，其与孤雌单倍体胚胎干细胞的主要区别在于： 进行激活之前还需先建立带有雄性基因组的“卵细胞”，主要通过向去核的卵母细胞中注入成熟精子头部和除去受精卵中雌原核这两种方法[3]。

2012年，Li[2]和Yang[3]的研究团队利用这两种方法分别建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系。研究证明，这类孤雄单倍体胚胎干细胞保留了精子携带的父源印记，能够替代精子与卵细胞，形成与受精卵相似的二倍体胚胎。2014年，Li[10]的研究团队再次宣布成功建立了大鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系。

3 单倍体胚胎干细胞的分化潜能

3.1 孤雌单倍体胚胎干细胞的分化潜能 在培养过程中，科学家已经发现小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞可以产生正常形态的胚状体并具有多向分化能力，同时还发现了其关键的多能标记基因的表达[6，7，11]。令人惊讶的是，后续随着人类单倍体胚胎干细胞系的建立，已有研究表明，与小鼠单倍体胚胎干细胞相比，人类单倍体胚胎干细胞更容易分化成所有三胚层，且仍能保持单倍性[8，9，12]。

3.2 孤雄单倍体胚胎干细胞的分化潜能 Yang[3]等通过类似的方式证明了孤雄单倍体胚胎干细胞具有生殖分化能力，且在E12.5d的嵌合胚生殖嵴中检测到了孤雄单倍体胚胎干细胞的存在。然而，在实验中也发现，相较于孤雌单倍体胚胎干细胞，孤雄单倍体胚胎干细胞分裂过程中更容易发生二倍化。

4 单倍体胚胎干细胞的遗传与表观遗传学特性

4.1 遗传学特性 通过流式细胞分析单倍体胚胎干细胞系中DNA的含量，发现无论是孤雌还是孤雄单倍体胚胎干细胞系，它们在有丝分裂G1期都含有1n倍的染色体，而在有丝分裂G2期则变为2n倍。值得注意的是，在孤雄单倍体胚胎干细胞系中的性染色体均只含一条X染色体，推测可能是由于Y染色体缺乏部分基因序列，导致仅携带Y染色体的孤雄单倍体胚胎干细胞发育异常，难以存活。2012年，Li[3]的研究团队利用孤雄单倍体胚胎干细胞代替精子与卵细胞完成“受精”作用，进而获得存活且可育的半克隆小鼠后代，同时发现这些能够成功存活的半克隆小鼠都是雌性。

4.2 表观遗传学特性 哺乳动物发展形成了基因组印记调控，所以哺乳动物单倍体胚胎干细胞的印记模式是其最重要的表观遗传学特性。基因组印记是指某个基因的等位基因根据亲本来源不同而有不同的表达，分为母源印记和父源印记，所以对应的单倍体胚胎干细胞分为孤雄单倍体胚胎干细胞和孤雌单倍体胚胎干细胞，其中主要的父源和母源印记基因分别是母系表达的印记基因(imprinted maternally expressed transcript，H19)和胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2)。正常的基因组印记是哺乳动物发育的基本条件，但在体外培养单倍体胚胎干细胞的过程中基因组的印记状态可能会发生改变，从而影响胚胎外膜和滋养层的正常发育，导致成活率降低，研究人员推测这可能与基因印记非甲基化有关[13]。基因印记的分子机制尚未完全明确，目前大多认为是DNA甲基化，甲基化通常抑制基因的表达，且富含CpG的差异性甲基化区域(differential methylation region， DMR)就是印记的修饰位点[14]。已经有许多研究表明，通过基因敲除的方式能够解决基因印记非甲基化的问题，并提高半克隆小鼠的成活率。

2004年，Kono等[11]利用H19和H19DMR完全敲除的non-growth卵，成功得到了孤雌来源的成年动物。随后又证实，如果进一步敲除小鼠12号染色体上的基因间区的差异甲基化区域(intergenic differentially methylated region， IGDMR)，能够将孤雌小鼠的发育效率提高30%。Zhong等[15]也尝试利用规律成簇的间隔短回文重复序列/核酸内切酶9(CRISPR-Cas9)技术制备H19DMR和IGDMR的双敲孤雌胚胎干细胞，并注入第二次减数分裂中期的卵母细胞，同样也较高效地获得了健康的半克隆小鼠。2012年，Zhong等[4]利用H19DMR和IGDMR的双敲除孤雄单倍体胚胎干细胞系，使产生健康半克隆小鼠的效率达到了22.3%，较之前Yang等[1]的研究结果提高了10倍。

5 单倍体胚胎干细胞的应用

单倍体胚胎干细胞在分子水平有着比较大的应用价值，能够广泛用于正向和反向遗传学研究，将CRISPR-Cas9技术与单倍体胚胎干细胞系的建立结合，就可以实现大规模的基因编辑，从而建立单倍体细胞突变文库。在细胞水平，单倍体胚胎干细胞的基因筛选可用于研究疾病表型与治疗、药物作用机制以及疾病发病机制等。研究发现，这些单倍体胚胎干细胞即使经过复杂的基因编辑操作，仍然能够维持其单倍性和多能性的特点。相比于精子与卵子来说，单倍体胚胎干细胞的结构与功能未发生特化，所以在体外能长期稳定培养与扩增，同时也可以对其进行基因操作和筛选。所以在个体水平，经基因改造的孤雄、孤雌单倍体胚胎干细胞可代替精子和卵子[13]，从而得到转基因半克隆小鼠，此方法极大地缩短了制备转基因小鼠的实验周期。Li等[2]利用CRISPR-Cas9技术已经成功获得了世界上首个由基因修饰的单倍体胚胎干细胞“受精”发育而成的健康转基因小鼠。CRISPR-Cas9技术的发展及其与单倍体胚胎干细胞的结合应用，提供了一种能够在短时间内建立携带可遗传基因修饰的转基因动物的新途径[2]。当然，利用单倍体胚胎干细胞不仅能获得基因修饰动物，还能利用单倍体胚胎干细胞实现同性生殖、研究物种间杂交。

人类单倍体胚胎干细胞系的建立为研究人类基因组功能以及发育机制提供了新颖的方式，也为生物医学的各种应用带来了新的曙光[12]；然而，由于涉及伦理问题，人单倍体胚胎干细胞在基因缺失研究方面的应用仅限于细胞水平。

6 结论与展望

单倍体胚胎干细胞具有多能性，能够在体外诱导分化成为不同类型的细胞，在癌症研究、再生医学和疾病建模等领域都具有重要的应用价值。但是，目前在单倍体胚胎干细胞的研究过程中还存在着许多问题，如单倍体胚胎干细胞容易发生二倍化以及半克隆小鼠的出生率低下等。此外物种差异对建系的影响，使得在哺乳动物中目前只成功建立起小鼠、大鼠、食蟹猴和人的单倍体胚胎干细胞系，其他物种尚未有成功的报道。总之，在人类发展和疾病研究的背景下，单倍体胚胎干细胞的研究还将是未来几年干细胞研究中的重要热点。