不同除草剂对玉米单倍体成熟胚的加倍效果

惠国强，侯 磊，杜彦超，王秀明，南芝润，贾聪慧

（1.山西农业大学玉米研究所，山西忻州034000；2.忻州师范学院生物系，山西忻州034000）

玉米作为世界三大粮食作物之一，2016 年，全世界种植面积约为1.95×108hm2，总产量约为1.10×109t，种植面积和产量均为世界农作物的第一；我国玉米种植面积约为3.66×107hm2，总产量约为2.20×108t，种植面积和产量均为我国农作物的第一[1]。

单倍体育种技术在玉米育种中被广泛应用，极大地加快了育种进程。常规选育玉米自交系，获得纯合自交系通常需要经过6～8 代。单倍体育种可以明显地缩短育种年限，纯合自交系的获得一般只需1～2 代自交，育种年限大大缩短[2]。直到20 世纪40 年代CHASE[3-6]才将选育的优良纯合DH 系用于商业杂交种生产。

加倍玉米单倍体主要采用自然加倍、化学加倍和N2O 气体加倍等方法。JENSEN[7]和TESTILLANO等[8]研究表明，一个单倍体植株的一小部分体细胞通过体细胞融合、核内复制、核内有丝分裂或者其他的一些机制来自然加倍。魏俊杰等[9]在六叶期和拔节期使用注射法加倍玉米单倍体，结果表明，不同浓度的秋水仙素溶液，在玉米六叶期的注射效果显著高于拔节期。KATO[10-11]研究表明，N2O 具有玉米苗期染色体加倍功能，其采用600 kPa 的N2O 气体处理8 种不同基因型的六叶期玉米苗2 d，结果显示，有44%的植株能自交结实。

玉米单倍体加倍的主要方法是化学加倍，采用的药剂主要有秋水仙素和除草剂。WAN 等[12-13]用秋水仙素（0.05%和0.025%）处理单倍体愈伤组织24、48、72 h，结果表明，处理 24 h 后，愈伤组织再生了约50%的单倍体；处理72 h 的愈伤组织中再生的都是双倍单倍体，除了少数四倍体，136 株再生植株中有107 株自交结实。慈佳宾等[14-15]采用氟乐灵、拿草特2 种除草剂处理玉米单倍体，结果表明，采用浸种法80 μmol/L 氟乐灵处理20 h，加倍率为35.7%；采用浸芽法 60 μmol/L 拿草特处理 24 h，加倍率为24.8%；采用浸根法40 μmol/L 氟乐灵处理15 h，加倍率为16.8%。

目前，玉米是唯一大规模培育单倍体的作物，尽管当前玉米单倍体加倍技术取得了长足的进展，但是加倍率、散粉率和成活率还是受到一定的限制，自然和化学加倍率依然偏低。化学加倍主要采用植株滴心法和种子处理法，这2 种方法技术繁琐，加倍效率偏低，且药剂对环境污染较严重。

本研究比较了不同浓度（1、5、10、20 μmol/L）的3 种除草剂（甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵）对玉米单倍体成熟胚的加倍效果，以期找到一种玉米单倍体加倍的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

供试玉米杂交种为先玉335、中地88 和郑单958；玉米单倍体诱导系来源于自选的母本诱导系JY-1；加倍药剂使用的是98%的甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵3 种除草剂原药（上海西格玛- 奥德里奇公司生产）。

1.2 方法

将试验材料种植于山西省农业科学院玉米研究所试验田。以诱导系作父本、玉米杂交种作母本，进行杂交，使用收获后的单倍体种子，待处理。

1.2.1 制备培养基 取MS 培养基，调pH 值至5.8～6.0，120 ℃高压灭菌10 min。使用1%的二甲基亚砜，将甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟乐灵原液分别配制成 1、5、10、20 μmol/L 的溶液，过滤灭菌。倒入适量的培养基至组培瓶。以未加除草剂的MS 培养基为对照。

1.2.2 成熟胚的切取及除草剂处理 无菌水清洗玉米单倍体种子，用75%的酒精浸泡5 min，再用0.1%的氯化汞浸泡10 min，无菌水清洗并浸泡24 h，超净工作台下切取单倍体籽粒白色的成熟胚。将成熟胚接入不同浓度的甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟乐灵的组培瓶及对照瓶，暗培养48 h。

1.2.3 成熟胚的转接及幼苗移栽 将处理后的成熟胚转接到不含除草剂的MS 培养基中。暗培养5 d后再光照培养，12 h 光照，12 h 黑暗。培养10 d 后，移入田间炼苗。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 19.0 分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度除草剂对玉米单倍体成熟胚加倍效果的影响

由表1 可知，除草剂浓度不同对玉米单倍体成熟胚加倍效果不同，玉米单倍体加倍率差异显著。其中，甲基胺草磷溶液（1～20 μmol/L）处理后，加倍率为10.80%～85.16%；炔苯酰草胺溶液（1～20 μmol/L）处理后，加倍率为 9.02%～75.83%；氟乐灵溶液（1～20 μmol/L）处理后，加倍率为7.83%～60.13%。所有处理加倍率均高于对照，其中，甲基胺草磷（10 μmol/L）加倍率最高，先玉 335 单倍体平均加倍率为85.16%，中地88 单倍体平均加倍率为80.20%，郑单958 单倍体平均加倍率为66.30%；炔苯酰草胺（10 μmol/L）加倍率次之，先玉 335 单倍体平均加倍率为75.83%，中地88 单倍体平均加倍率为74.76%，郑单958 单倍体平均加倍率为60.12%；氟乐灵（5 μmol/L）加倍率最低，先玉 335 单倍体平均加倍率60.13%，中地88 单倍体平均加倍率56.33%，郑单958 单倍体平均加倍率为45.06%；随着3 种除草剂浓度的增加，对玉米成熟胚的抑制效果逐渐加大，加倍率先升后降。

2.2 不同基因型单倍体加倍效果分析

从表1 可以看出，先玉335 单倍体的加倍率为15.50%～85.16%，中地88 单倍体的加倍率为13.08%～80.20%，郑单958 单倍体的加倍率为7.83%～66.30%，所有处理加倍率均高于对照。先玉335、中地 88 和郑单 958 这 3 个杂交种中，10 μmol/L甲基胺草磷加倍率最高，分别为85.16%、80.20%和66.30%。

从表2 可以看出，10 μmol/L 甲基胺草磷溶液处理不同基因型的玉米单倍体加倍效果有差异，其中，单倍体平均加倍率最好的是先玉335，达85.16%，中地88 的单倍体次之，为80.20%，郑单958 的单倍体最低，为66.30%。方差分析表明，先玉335 与郑单958 的单倍体加倍率、中地88 与郑单958 的单倍体加倍率均呈显著差异；先玉335 与郑单958、中地88 与郑单958 的单倍体加倍率呈极显著差异；先玉335 与中地88 的单倍体加倍率无显著差异。

表1 不同浓度除草剂对玉米单倍体成熟胚加倍效果的方差分析

表2 10 μmol/L 甲基胺草磷对不同基因型单倍体加倍效果的方差分析

3 结论与讨论

玉米单倍体加倍效果除了与加倍药剂和加倍方法有关外，还与单倍体材料的基因型有很大关系。魏俊杰等[10]利用0.5%秋水仙素处理六叶期的玉米生长点，不同基因型材料加倍率为19.74%～20.80%。徐国良等[16]研究了12 份不同种质的玉米单倍体材料，其加倍率存在很大差异，加倍率最高为19.19%，最低为5.62%。本研究中，不同基因型玉米单倍体成熟胚加倍效率最高的是10 μmol/L 甲基胺草磷溶液。玉米单倍体加倍效果受基因型限制，基因型不同，加倍效果有差异，这与徐国良等[16]、魏俊杰等[10]人的研究一致。

3 种除草剂（甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵）对玉米单倍体成熟胚的加倍效果明显，其中，10 μmol/L 甲基胺草磷的加倍率最高，不同基因型玉米单倍体成熟胚的加倍率差异明显。