选择离子气质联用法同时测定食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

孟 颖，闫 璐，胡 洁，王皓铭，王思佳，李争春，胡永钢，张生万，*

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西大学化学化工学院，山西太原030006）

焦糖色素是一种世界广泛使用的食品色素，占整个食品着色剂使用量的90%以上[1]，由于它的色泽，口感和良好的稳定性，被广泛的用于食醋、酱油、饮料和啤酒等食品中[2]。现在市场上广泛使用的焦糖色素多为氨（铵）法生产，在生产过程中产生一定量的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[3]。有研究表明，4-甲基咪唑有类似吡啶、吡咯的毒性，抑制细胞色素P450同功酶，它在人的肝脏中发生催化反应，产生许多低分子质量的致癌物[4]。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑属同分异构体[5]，能诱发动物惊厥[3]还会导致甲状腺肿瘤[6]。世界卫生组织和我国国标GB 8871-2001均规定氨（铵）法生产的焦糖色素中4-甲基咪唑的含量不得超过0.02%，而未对2-甲基咪唑的含量做出规定[7-8]。为了提供一个控制食品质量与安全的有力依据，建立快速有效的检测食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的方法极其重要。

目前，文献报道的薄层色谱法[8]、分光光度法[9]、气相色谱法[10]是对焦糖色中的4-甲基咪唑进行检测；高效液相色谱法[11]对饮料中的4-甲基咪唑进行检测；气质联用法[1-2，4，7]分别对液态调味料、软饮料、焦糖色和炭烧咖啡中的4-甲基咪唑进行检测。用选择离子（SIM）气质联用色谱法同时测定食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法在国内外尚未见文献报道。本文对各类色谱条件进行筛选优化，并对市售食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2-甲基咪唑、4-甲基咪唑 分析纯，西亚试剂；N-甲基甲酰苯胺 分析纯，TCI公司；二氯甲烷（分析纯）、氢氧化钠（分析纯） 天津市进丰化工有限公司；硅藻土 天津光复精细化工研究所；食醋市售。

Agilent 7890-5975C型GC/MS联用仪 配有电子轰击离子源（EI），美国Agilent公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 杭州瑞佳精密科学仪器有限公司；BS 124S型分析天平 Satrorius公司；玻璃层析柱（30mm×300mm）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 内标溶液的配制 称取N-甲基甲酰苯胺0.0506g，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解后定容，摇匀，得浓度为1.01mg/mL的储备液；取1.25mL浓度为1.01mg/mL的溶液至50mL容量瓶，定容后摇匀，得浓度为25.3μg/mL的溶液，备用。

1.2.1.2 混合标准品储备液的配制 分别称取2-甲基咪唑和4-甲基咪唑0.0504g，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解后定容，摇匀，得浓度为1.01mg/mL的储备液；取2.50mL浓度为1.01mg/mL的储备液至25mL容量瓶，用二氯甲烷定容后摇匀，得浓度为101μg/mL的标准液，备用。

1.2.2 样品前处理 先取25.0mL样品于50mL烧杯中，用10mol/L的NaOH溶液调pH至11，加入硅藻土30g与样品混合至半干，将混合物装入有活塞的层析柱。加入50mL二氯甲烷静置30min。用150mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至2～3mL。转移至10mL容量瓶中，加入1mL浓度为25.3μg/mL的内标储备液，定容。

1.2.3 色谱与质谱条件

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱：RTX-WAX（30m×250μm×0.5μm）；载气：He；恒流，柱流量：1.5mL/min；分流进样，分流比：2∶1；进样量：2μL；进样口温度：250℃；柱初温：120℃，保持3min，以15℃/min的速度升至230℃，保持30min。

1.2.3.2 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度250℃；四级杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟时间4min；扫描方式选择离子扫描模式（SIM）；4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的特征离子都为m/z82和54.1，以m/z82为定量离子；N-甲基甲酰苯胺的特征离子为m/z135和106，以m/z135为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

分别选择RTX-WAX、HP-5不同极性的色谱柱进行实验。图1为RTX-WAX色谱柱进行实验所得色谱图。结果表明：选用RTX-WAX极性柱响应值较高且峰形好，2-甲基咪唑、4-甲基咪唑完全分离。

图1 RTX-WAX色谱柱实验所得总离子流色谱图Fig.1 The Total ion chromatogram of experiments by RTX-WAX column

2.2 内标物的选择

分别选择咪唑[4，7]、2-乙基咪唑[2，4，7]和N-甲基甲酰苯胺不同的内标物在相同的色谱条件下进行实验，结果见图2。结果表明：咪唑与4-甲基咪唑出峰时间相同，无法实现完全分离；2-乙基咪唑与2-甲基咪唑虽然达到分离，但分离效果不理想；N-甲基甲酰苯胺不仅出峰快，峰形好，而且与被测组分达到完全分离，因此选用N-甲基甲酰苯胺为内标物。

图2 不同内标物与被测物的总离子流色谱图Fig.2 The total ion chromatogram of different internal standards and analytes

2.3 GC-MS离子对的选择

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑属于同分异构体，对其进行全扫描，质谱图见图3，通过全扫描确定化合物的特征离子有m/z82.0、54.1。以m/z82.0作为2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定量离子，以m/z54.1作为2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定性鉴别离子。对N-甲基甲酰苯胺进行全扫描，质谱图见图4，确定其特征离子有m/z135.0和106.0。以m/z135.0作为N-甲基甲酰苯胺的定量离子，以m/z106.0作为其定性离子。

2.4 标准曲线和检出限

分别精确移取2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准液0.03、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50mL置于10mL容量瓶中，各加入1.00mL浓度为25.3μg/mL的内标液，定容摇匀，得系列标准液，其中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑浓度分别为0.303、0.505、1.01、5.04、10.1、15.2μg/mL，在选择离子模式下（SIM）平行测定三次，以被测物峰面积与内标物峰面积的比值对其浓度进行线性回归，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的线性回归方程分别为：y=0.2263x-0.0382，R=0.9997和y=0.194x-0.047，R=0.9996，其标准曲线见图5。

图3 2-甲基咪唑（a）和4-甲基咪唑（b）的质谱图Fig.3 The mass spectrum of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

图4 N-甲基甲酰苯胺的质谱图Fig.4 The mass spectrum of N-methyl-formanilide

图5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的标准曲线Fig.5 Standard curve of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

结果表明，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在0～15.2μg/mL的范围内线性关系良好；按3倍信噪比计算2-甲基咪唑、4-甲基咪唑检出限分别为0.0106、0.0160μg/mL，表明该方法具有较高的灵敏度。

2.5 精密度

在1.2.3项的条件下，对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑浓度均为5.05μg/mL的溶液连续进样6次，结果见表1。从表1可知，以峰面积计算2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的相对标准偏差分别为3.0%和3.1%，表明该方法精密度良好。

2.6 回收率

精密移取已知2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的样品3份，置于5mL容量瓶中，分别向其中准确加入10.1μg/mL的溶液0.50、0.70、0.90mL，每份2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的加入量均分别为5.05、7.06、9.07μg，再各加入0.5mL 25.3μg/mL的内标储备液，定容摇匀，进行测定，结果见表2。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的平均回收率分别为101.3%和99.3%，表明该方法具有较高的准确性。

2.7 样品测定

表1 精密度实验结果Table 1 The results of RSD by SIM-GC/MS

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率结果Table 2 Recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole by SIM-GC/MS

分别对5种市售样品按1.2.2项的方法处理，在1.2.3项的条件下进行定性定量分析，结果见图6、表3。

图6 样品的选择离子色谱图Fig.6 The selected ion mass spectrum of the sample

表3 样品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的测定结果Table 3 The measurement results of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the sample

由图6可知，市售的食醋中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均有检出，计算各样品中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量，2-甲基咪唑的含量在0.210～0.850mg/L，4-甲基咪唑的含量在0.776～1.672mg/L范围内。

3 结论

本文建立了选择离子气质联用法同时测定食醋中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的新方法。结果表明：2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的线性范围均在0～15.2mg/L范围内呈良好线性关系，其相关系数分别为0.9997和0.9996；相对标准偏差分别为3.0%和3.1%；2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的平均回收率分别为101.3%和99.3%。该法具有高灵敏度，定量准确度更高等优点。本法用于市售食醋的分析，取得了满意结果。

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