粘质沙雷氏菌的分离鉴定及产红色素培养基的优化

季秀玲，林连兵，张 琦，魏云林

（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

很多天然色素安全可靠、没有毒副作用，色调自然，接近天然物质，其中很多品种均具有生理活性，如β-胡萝卜素在抗癌、预防心血管疾病及白内障上有显著功能，因此开发天然色素是国际上研究的重点。

灵菌红素是具有三个吡咯环骨架结构的天然红色素，具有抗细菌、真菌、疟疾和霉菌、抗病毒、免疫抑制和抗肿瘤等作用[1-4]。作为一种新的天然抗癌待选药物，灵菌红素已逐渐成为国内外癌研究的热点之一[5-7]；而微生物发酵生产的灵菌红素更是比较理想的天然色素，因此该色素具有很好的应用前景。随着现代生物技术的迅速发展和对灵菌红素的深入研究，灵菌红素的产生和作用机制将会被更加清晰地认识，大量制备，并应用于免疫治疗以造福于人类。

本文从昆明冶炼厂废水中筛选得到一株产红色素的KMR-3菌株，对其形态特征、生理生化鉴定以及基于16S rRNA序列的系统发育分析进行了研究，并以KMR-3为出发菌株，对其产红色素的培养基进行了优化，通过全波长扫描，初步确定红色素为灵菌红素。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋白胨、酵母膏、NaCl 分析纯，天津化学试剂三厂；pMD18-T载体、T4 DNA连接酶（经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测其纯度大于95%） TaKaRa大连宝生物。

PCR扩增仪 杭州博日科技有限公司；UV1700紫外分光光度计 日本岛津公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；ZWY-1102恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Gel Doc XR凝胶成像系统 美国BIORAD公司；Sigma 1-14离心机 德国Sigma公司；细菌生化微量鉴定管 杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 KMR-3菌株的分离 采集云南省昆明冶炼厂周围的废水，水温15℃，pH5.0左右。将采集到的样品经滤纸过滤，取2mL滤液于100mL LB液体培养基中进行富集培养，15℃，150r/min培养24h。吸取10μL富集培养的混合菌液，稀释10倍、100倍、1000倍涂布LB平板（Φ＝9cm）：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。15℃，150r/min培养24h，然后挑取不同单菌落于LB平板上划线分离纯化，获得单菌落。

1.2.2 生理生化特性

1.2.2.1 KMR-3菌落及菌体形态的观察 吸取20μL新鲜培养的KMR-3菌液，稀释不同倍数，涂布于LB固体平板上，15℃培养2d，观察KMR-3菌株菌落形态；革兰氏染色观察KMR-3菌体形态。

1.2.2.2 生长温度对KMR-3菌株产红色素影响 涂布10μL新鲜培养的KMR-3菌液于LB固体平板上，分别置于4、15、28、37、42℃培养，观察细菌生长状况及温度对色素产生的影响。

1.2.2.3 生长pH对KMR-3菌株产红色素的影响 接种10μL新鲜培养的KMR-3菌液于不同pH（1～14）的5mL LB液体培养基中，28℃，150r/min，培养24h，观察菌体生长pH范围。

1.2.2.4 生理生化特征鉴定[8]KMR-3菌株于28℃，150r/min，培养12h，取5μL新鲜培养液接种于细菌生化微量鉴定管内，28℃培养24h，观察结果。鉴定项目有：糖醇类的氧化发酵实验（包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、卫矛醇）、H2S产生实验、赖氨酸脱羧酶实验、鸟氨酸脱羧酶实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、尿素实验、丙二酸盐实验、侧金盏花醇实验、葡萄糖磷酸盐胨水实验、西蒙氏枸橼酸盐实验。

1.2.3 分子生物学分类鉴定 利用16S rRNA基因的一对通用引物进行PCR扩增，引物序列为：f15′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，r25′-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR扩增程序：94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶检测后，与pMD18-T载体连接，电转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布含有氨苄青霉素（Amp）的LB平板，置于37℃培养12h。通过T载体的通用引物M13（RV/M4）检测转化产物。PCR扩增验证的产物由北京三博远志公司测序部进行双向测序，序列提交GenBank，通过Blast进行序列同源性检索分析。利用MEGA 4.1软件构建系统发育树，确定KMR-3菌株的分类学地位。

1.2.4 红色素全波长扫描 将制得的色素样品溶解在酸性甲醇溶液中，在200～700nm范围内进行全波长扫描[9-10]。

1.2.5 色素产量的评定 KMR-3菌株发酵温度为28℃，pH为5.0。对不同培养时间的发酵液取样，通过离心取上清测定OD535值初步评估色素产量。

1.2.6 培养基成分的优化

1.2.6.1 不同培养基的确定 以LB液体培养基作为起始培养基，不同培养基的优化（不含胰蛋白胨、不含酵母粉和不含NaCl的LB改良培养基）见表1中的LB-1、LB-2和LB-3，分别于0、6、12、24、36、48、60、72和90h对发酵液取样，离心取上清测定OD535值。

1.2.6.2 胰蛋白胨添加量的确定 以只含胰蛋白胨（5、10、15g/L）的液体培养基进行发酵，见表1中的LB-4、LB-5和LB-6，发酵液取样时间同1.2.6.1，离心取上清测定OD535值。

1.2.6.3 甘油添加量的确定 以5g/L胰蛋白胨和0.5%、1%和2%甘油的液体培养基进行发酵，见表1中的LB-7、LB-8和LB-9，发酵液取样时间同1.2.6.1，离心取上清测定OD535值。

表1 产红色素培养基的组成Table 1 Compositions of media used for production of red pigment

2 结果与讨论

2.1 KMR-3菌株的分离筛选

从冶炼厂周围的废水中分离到14株不同的细菌，其中KMR-3菌株能够产生红色素（图1）。因此对该菌株进行形态学、生理生化特性及16S rRNA基因分析。

图1 KMR-3菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphological character of KMR-3 strain

2.2 KMR-3菌株的菌落及菌体形态

KMR-3菌株在LB平板上，15℃培养2d，菌落产生红色素，菌落直径约2mm，圆形，边缘整齐，表面光滑，较粘稠，易挑起（图1），菌体革兰氏染色为阴性、该菌菌体细胞为短杆状，端圆。

2.3 生理生化特征

2.3.1 生长温度对产红色素影响 KMR-3菌株能在4、15、28、37℃培养条件下生长，在42℃不生长（表2）；4～28℃培养产生红色色素，但37℃培养不产生色素，而把培养温度从37℃降低到28℃培养又可产生红色色素[11]，这与沙雷氏菌的特征很相近。而沙雷氏菌属中有3个种可以产生灵菌红素，分别为粘质沙雷氏菌、深红沙雷氏菌和普城沙雷氏菌。因此还需通过其他的生理生化特征进行进一步地鉴定。

表2 不同温度条件下KMR-3生长状况及产色素情况Table 2 Growth and pigment of KMR-3 at different temperatures

2.3.2 生长pH对产红色素影响 KMR-3菌株能在pH4～10范围的LB液体培养基中生长，且均产生红色素（表3），其中在pH5.0附近生长最快，初步认定为该菌的最适生长pH。

表3 KMR-3菌体生长pHTable 3 Growth of KMR-3 at various pH

2.3.3 菌株生理生化特征鉴定 KMR-3菌株能以葡萄糖、山梨醇、侧金盏花醇、丙二酸盐和西蒙氏枸橼酸盐作为唯一碳源生长，不能以乳糖和卫矛醇作为唯一碳源生长，不能利用尿素，不能产生H2S，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶反应为阳性（表4）。因此，通过生理生化特征进一步表明，KMR-3菌株与已报道的粘质沙雷氏菌特性一致[12]，因此KMR-3菌株属于粘质沙雷氏菌。

表4 KMR-3菌株生理生化特征Table 4 Physiological characteristics of KMR-3 strain

2.4 KMR-3菌株分子生物学鉴定

KMR-3菌株16S rRNA基因序列全长为1505bp，GenBank登录号（Accession Number）为DQ629026.1。经NCBI Blastn分析，表明其与Serratia marcescens同源性最高，达99.9%，利用MEGA 4.1软件构建了系统发育树，如图2所示。

图2 KMR-3与相关菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain KMR-3 and its relatives

从系统进化树可看出，KMR-3菌株与Serratia属中的各菌株归于同一簇群。因此，依据形态学和生理生化实验的结果，将其鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的一个菌株。KMR-3在系统发育地位上属于Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacteriales；Enterobacteriaceae；Serratia；Serratia marcescens。

2.5 红色素全波长扫描

色素样品在酸性条件下的最大吸收波长为535nm（图3），与灵菌红素的吸收波长一致，由此初步确定该色素为灵菌红素[13-15]。

图3 红色素的全波长扫描图谱Fig.3 Full wavelength scanning of red pigment

2.6 培养基成分的优化

2.6.1 不同培养基的确定 不同培养时间对发酵液取样、离心取上清测定OD535值初步评估色素产量（图4）。结果表明：发酵12h时，不含NaCl的LB-3培养基产色素能力较强，出现一个小的峰值；而发酵至48h时不含酵母粉的LB-2培养基产色素能力最强。因此采用不含酵母膏和NaCl即只含不同浓度胰蛋白胨的培养基（LB-4、LB-5和LB-6）进行发酵优化实验。

图4 不同培养基组分对色素产量影响Fig.4 Effect of different mediums on the yield of the red pigment

2.6.2 胰蛋白胨添加量的确定 不同培养时间对发酵液取样、离心取上清测定OD535值初步评估色素产量（图5）。结果表明：发酵36h时，与起始LB培养基相比，含5g/L胰蛋白胨的LB-4培养基产色素能力提高2倍，而10g/L和15g/L胰蛋白胨的LB-5和LB-6培养基产色素能力反而降低（图5）。因此，以LB-4培养基进行发酵优化实验。

图5 不同蛋白胨含量对色素产量影响Fig.5 Effect of different tryptone content on the yield of the red pigment

2.6.3 甘油添加量的确定 针对粘质沙雷氏菌发酵产灵菌红素培养基的配方的研究表明：对产色素来说，醇类物质如甘露糖、甘油、乙醇等是常用的碳源[16]。因此以甘油作为碳源优化了培养基。

不同时间对发酵液取样、离心取上清测定OD535值评估色素产量（图6），结果表明以5g/L胰蛋白胨和1%甘油的LB-8培养基产色素能力最强，是起始LB培养基的13.4倍。

目前对于粘质沙雷氏菌灵菌红素的研究集中于高产菌种的获得和生产工艺的优化方面，以提高该天然色素的产量，降低生产成本。例如Tao Jinli等通过补料分批发酵的方式提高灵菌红素的产量[17]；Wei Yuhong等添加氨基酸的方式提高SS-1菌株灵菌红素产量[18]；韦凤等分离到一株Sm-128菌株，灵菌红素粗品产量达到475mg/L[19]；郝名慧等分离获得H31菌株并确定最优的碳源、氮源和无机盐分别为蔗糖、牛肉膏和CaCl2，最终发酵液中灵菌红素的OD535达到142.638[14]。本研究通过优化LB培养基组份及及含量，提高了KNR-3菌株产色素能力。

图6 不同甘油浓度对色素产量影响Fig.6 Effect of different concentrations of glycerol on the yield of the red pigment

3 结论

从昆明冶炼厂废水中筛选得到一株产红色素的KMR-3菌株，经形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析将其初步鉴定为粘质沙雷氏菌。通过优化LB液体培养基不同组分及含量，表明5g/L胰蛋白胨和1%甘油的液体培养基为最优培养基，其产色素能力是起始LB培养基的13.4倍。该培养基不仅具有安全性和蛋白用量少的特点，而且促进粘质沙雷氏菌快速产生大量红色素，适用于现代生物工程中细菌次生代谢产物发酵、实验室培养基和开发天然色素等领域。

[1]Slater H，Crow M，Everson L，et al.Phosphate availability regulates biosynthesis oftwo antibiotics，prodigiosin and carbapenem，in Serratia via both quorum-sensing-dependent and-independent pathways[J].Molecular Microbiology，2003，47（2）：303-320.

[2]Bennett J W，Bentley R.Seeing red：the story of prodigiosin[J].Advance in Applied Microbiology，2000，47：1-32.

[3]Melvin M S，Wooton K E，Rich C C，et al.Copper-nuclease efficiency correlates with cytotoxicity for the 4-methoxypyrrolic natural products[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2001，87（3）：129-135.

[4]Jing Zhang，Jianwen Liu，Yaling Shen，et al.Inhibitive effect of prodigiosin on the proliferation of Human malignant pancreatic cancer cells[J].Medicinal Chemistry Research，2005，14（4）：181-197.

[5]沈亚领，刘建文，魏东芝，等.灵菌红素对人胰腺细胞增殖抑制的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（5）：504-509.

[6]李俊华，吴晓鹏，方哲，等.海洋弧菌B2817的抗肿瘤活性成分研究[J].中国海洋药物杂志，2008，27（5）：8-10.

[7]Montaner B，Pemz-Tomas R.The cytotoxic predigiesin induces phosphorylation of p38-MAPK but not of SAPK/JNK[J].Toxicology Lett，2002，129（1/2）：93-98.

[8]潘园园，陈雯莉，黄巧云.一株抗重金属铜镉细菌的分离、鉴定及其16S rDNA的序列分析[J].微生物学通报，2005，32（3）：68-72.

[9]薛建，刘青，杨启银.粘质沙雷氏菌发酵产红色素培养基及其结构研究[J].安徽农业科学，2009，37（12）：5375-5378.

[10]黄小龙，黄东益，周双清，等.粘质沙雷氏菌产灵菌红素培养基的筛选[J].生物技术，2009，19（5）：65-67.

[11]黄文芳.粘质沙雷氏茵（Serratia marcescens）的研究I Serratia marcescens 9-2菌株分离、分类鉴定和形态特征[J].华南师范大学学报：自然科学版，2003（3）：108-111.

[12]王大耜.细菌分类基础[M].北京：科学出版社，1977.

[13]Lewis S M，Corpe W A.Prodigiosin-produeing bacteria from marine sources[J].Applied Microbiology，1964，12（1）：13-17.

[14]郝名慧，楼志华，张粱，等.一株新粘质沙雷氏菌发酵产红色素及其结构的研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（3）：439-442.

[15]李厚金，蔡创华，周毅频，等.大亚湾海洋细菌Pseudomonas sp.中的红色素[J].中山大学学报：自然科学版，2003，42（3）：102-10.

[16]Kobayashi N.Influence of carbon source on the biosynthesis of prodigiosin in Serratia marcescens[J].Journal of Saitama Medical School，1981，8（3）：97-102.

[17]Tao Jinli，Wang Xuedong，Shen Yaling，et al.Strategy for the improvement of prodigiosin production by Serratia marcescens mutant through fed-batch fermentation[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2005，21（6/7）：969-972.

[18]Wei Yuhong，Yu wanju，Chen Weichuan.Enhanced undeeylprodigiosin production from Serratia marcescens SS-1 by medium formulation and amino acid supplementation[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100（4）：466-471.

[19]韦凤，蒋冬花，蔡琪敏，等.一株高产灵菌红素粘质沙雷氏菌的筛选与鉴定[J].浙江师范大学学报：自然科学版，2011，34（3）：339-344.