部分苹果属种质遗传多样性分析及分子身份证构建

侯丽媛 ，董艳辉 ，邓 舒 ，肖 蓉 ，张春芬 ，赵 菁 ，曹秋芬

（1.山西农业大学（山西省农业科学院）生物技术研究中心，山西太原030031；2.山西农业大学（山西省农业科学院）果树研究所，山西太原030031）

苹果树是世界上最重要的果树之一，而我国是世界上最大的苹果生产国，每年的苹果出口量也位居世界前列。苹果品质资源复杂多样，加之我国乃至世界各地的频繁交流，很容易造成苹果种质的混杂，为了对苹果种质资源进行保护，有必要对苹果品种资源进行准确鉴定，这也是对苹果种质资源保存和利用的前提，更是对其进行知识产权保护的必要手段。

SSR 标记是特异性强的一类分子标记技术，具有共显性、丰富的多态性、高度重复性及可靠性，同时操作简单等优点，近年来应用非常广泛[1]，是构建指纹图谱比较理想的分子标记[2-3]。荧光SSR 分子标记技术是在SSR 分子标记基础上发展起来的和荧光测序技术有效结合的一种新技术。其具有高度智能化特点，这种标记利用测序仪对PCR 产物进行自动检测，不仅效率高而且灵敏度和准确性好，同时还避免了人工判读条带带来的误差。目前，荧光SSR 分子标记已被应用于许多园艺植物研究中[4-5]，而且国内外园艺植物DNA 分子身份证研究方面已取得了许多进展[6-11]。

本研究通过对选取的山定子和我国华北地区种植面积相对较大的25 份苹果栽培品种作为试验材料，运用荧光SSR 分子标记技术对供试材料进行分子鉴定，并在此基础上对供试材料进行了遗传多样性分析，同时建立了各供试材料的指纹图谱和分子身份证，并在分子水平对山定子作为最常用苹果砧木进行了验证，旨在为苹果种质资源的利用与知识产权保护提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

为保证供试材料的可靠性，本研究选用的试验材料均取自国家果树种质兴城苹果圃，包括砧木系材料1 份（山定子），栽培品种25 份，其中，美国育成品种11 份、日本育成品种7 份、我国育成品种6 份、加拿大育成品种 1 份（表 1）。

表1 26 份供试材料来源

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 提取和引物合成 采用德国QIAGEN 的 DNeasy Plant Mini Kit 的 DNA 试剂盒提取供试材料春季嫩叶基因组DNA。

表2 16 对荧光标记SSR 引物及退火温度

SSR 引物序列选择扩增片段长度100～300bp，结合 HOKANSON 等[12]、LIEBHARD 等[13]、YAMAMOTO 等[14-15]、GUILFORD 等[16]和高源等[17]报道的 SSR引物序列，同时参考高源等[18]报道的荧光标记引物，在对大量苹果品种鉴定的基础上，共筛选出16 对荧光SSR 引物用于本试验（表2）。带有6-FAMTM荧光标记的5′端SSR正向引物和SSR 反向引物均由上海Sangon 公司合成。

1.2.2 试验程序 PCR 反应体系和PCR 程序参照文献[19]，并稍作修改。其中，PCR 反应体系为 15 μL，包括模板DNA（20 ng/μL）3 μL、F-primer（2 μmol/L）1.5 μL、R-primer（2 μmol/L）1.5 μL、10×PCR Buffer（不含 Mg2+）1.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）0.9 μL、dNTP（25 mmol/L）0.12 μL，Taq酶（5 U/μL）0.12 μL，ddH2O 6.36 μL。

PCR 程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，退火1 min（退火温度因引物而异），72 ℃延伸2 min，32 个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

PCR 扩增采用乙醇进行纯化，95 ℃变性5 min，在美国ABI 3730 基因测序仪上对纯化后的SSR荧光标记产物进行荧光检测，并对原始数据进行收集。

1.2.3 核心引物筛选 在前期筛选出的16 对荧光SSR 引物中进一步筛选出7 对SSR 核心引物用于分子身份证构建。这7 对SSR 核心引物能对本研究选用的试验材料进行有效的区分，其分别是GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、H02d08、CH02d12。

1.3 数据处理与分析

对ABI3730 基因测序仪上获得的不同样品的指纹数据（即不同样品在每个SSR 位点的扩增片段长度）利用GeneMapper 3.0 软件进行分析。遗传数据分析利用软件GenAlEx 6.501 进行，计算遗传多样性指标多态性等位基因数（Na）、SSR 位点的有效等位基因数（Ne）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农多样性指数（I）以及固定指数（F）等。

采用Jaccard 相似系数，对供试材料的SSR 数据应用NTSYS-pc 2.10e 软件进行计算，得到相似系数矩阵，然后利用UPGMA（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）方法进行聚类分析，从而构建出供试材料基因型间的亲缘关系树状图。

利用PopGen 32 软件对获得的供试材料的指纹数据进行分析，得到各荧光SSR 引物多态性，然后将每对引物获得的等位基因从小到大按照顺序进行排序，并对排列的等位基因用阿拉伯数字从0开始赋值，对供试材料在7 个SSR 位点获得的等位基因按照赋值数字分别进行编码，即可获得每份供试材料独有的字符串。在此基础上，将每份材料按照相同位点顺序排列的编码字符串利用条码技术转化成每份材料独特的条码标识，即得到不同材料的分子身份证。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

16 对荧光SSR 位点的遗传多样性进行特征分析，结果如表3 所示。

表3 16 对荧光SSR 位点的遗传多样性特征分析

对供试的26 份材料基因组DNA 在16 对荧光SSR 标记的位点进行PCR 扩增，共得到139 个多态性等位基因，其中，多态性等位基因数在5（NH015a）和 11（CH05e03）之间，平均等位基因数（Na）为7.938，供试样品在每个荧光SSR 位点产生2 个相同（表现为单峰）或不同（表现为双峰）的等位基因数；有效等位基因数（Ne）在 2.711（GD147）和 6.563（GD142）之间，平均值为 4.123；观察杂合度（Ho）在 0.654 和 0.962 之间，平均值为 0.802；期望杂合度（He）在0.631 和0.848 之间，平均值为0.743；无偏杂合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之间，平均值为0.758；香浓多样性指数（I）在1.147和1.977 之间，平均值为1.616；固定指数（F）平均值为 -0.082（表 3）。

2.2 指纹图谱构建

利用筛选出的16 对SSR 荧光引物对26 份供试材料进行扩增，准确获得了不同材料在不同位点的等位基因片段大小以及相应的毛细管电泳图，即指纹图谱（图1）。每对SSR 引物的扩增带型为5～11 个，平均为 7.938 个。26 份苹果种质在 16 对荧光SSR 位点的指纹图谱互不相同（表4），是各种质的特定谱带，获得的指纹图谱可以为种质鉴定提供理论依据。

表4 26 份试材在16 对SSR 位点的指纹图谱

续表4

2.3 聚类分析

根据16 对SSR 荧光标记扩增26 份苹果种质的标记信息计算不同种质间的相似系数，得到各材料的Jaccard 系数矩阵，并在此基础上，利用UPGMA 对供试材料进行聚类分析，构建出供试材料基因型间的亲缘关系树状图（图2）。

26 份供试材料之间的Jaccard 相似系数分布在0.617 和 1.000 之间，平均值达到 0.805（表 5），说明各供试材料之间在分子水平上亲缘关系相对较近（图2）。以相似系数0.617 为标准，可以明显分为2 个类群，类群I 为山定子组，只有一个种质——山定子；类群II 为苹果组，包括除山定子以外的其他苹果栽培品种。以相似系数0.680 为标准，苹果栽培品种分为5 类。

表5 26份供试材料相似系数

2.4 分子身份证的建立

对26 份供试材料在7 对荧光SSR 位点获得的指纹图谱数据从小到大按顺序进行排列，并从0 开始用阿拉伯数字进行赋值，其结果列于表6。例如，荧光SSR 引物CH01f02 对供试材料进行PCR 扩增共获得了10 个等位基因片段，其中，最小的等位基因片段为162 bp，最大的等位基因片段为206 bp，对未获得等位基因的位点标记为-9；先将等位基因片段按照从小到大顺序排列，并从0 开始赋值，即将最小等位基因片段162 bp 赋值为0，最大等位基因片段206 bp 赋值为10，这样即得到了每份材料在荧光SSR 引物CH01f02 独有的字符串。以金冠为例，在 7 个荧光 SSR 位点 GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、CH02d08 和 CH02d12 获得的等位基因分别为 142、135、214/233、116/118、170/179、225/225、220/232 bp，其对应的赋值分别为 6、4、0/5、3/4、1/9、4/5 和 3/6，按照排列获得的字符串即为66440534134536。然后再将字符串利用条形码技术转化成独特的条形码标识即为分子身份证（表7）。

表6 等位基因的赋值标准

表7 供试材料的分子身份证

3 讨论

3.1 构建分子身份证的意义

种质资源是亲代传递给子代基因的载体，是种质创新和培育作物新品种的原始材料。种质资源的研究对于种质资源的利用效率、作物育种和生产发展的水平具有一定的意义[20]。在苹果种质资源方面，一方面随着各地苹果种质资源的频繁交流，造成了种质混杂现象层出不穷；另一方面随着苹果新品种的选育和推广，急需对种质资源进行准确鉴定和保护。种质资源的准确鉴定为知识产权的保护及利用提供了保障。指纹图谱数字化后的结果即为分子身份证，各品种的分子身份证可以通过计算机进行自动比对，更高效、方便和准确。另外，分子身份证能够简单明了地区分品种间的差异，可以在大规模品种比对中广泛使用。

3.2 遗传多样性分析

本研究利用16 对荧光SSR 引物在26 份材料中共扩增出139 个多态性等位基因，多态性等位基因数在 5（NH015a）和 11（CH05e03）之间，平均等位基因数（Na）为7.938；供试样品在每个荧光SSR 位点产生2 个相同（表现为单峰）或不同（表现为双峰）的等位基因数；有效等位基因数（Ne）在2.711（GD147）和 6.563（GD142）之间，平均值为 4.123；观察杂合度（Ho）在0.654 和0.962 之间，平均值为0.802；期望杂合度（He）为 0.631～0.848，平均值为0.743；无偏杂合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之间，平均值为0.758。

一般认为，没有经过高强度的人工选择，遗传多样性较高的种群杂合度高于0.5[21]。本研究中，观察杂合度、期望杂合度和无偏杂合度期望值均高于0.5，说明材料间遗传多样性相对较高。固定指数也称为近交系数，是群体中杂合子频率差异的估计值，是用来衡量群体是否随机交配的重要指标，通过杂合子频率偏差反映群体在某个位点的遗传分化程度[22]。本研究中，26 份苹果属材料在16 对荧光SSR位点检测固定指数，平均值为-0.082，结果显示，供试材料之间杂合子缺陷度不高，同时也表明Hardy-Weinberg 平衡的偏离程度不大。固定指数在5 个SSR 位点为正值，说明在一定程度上杂合子缺乏，纯合子过量，材料间存在近交现象；在11 个SSR位点为负值，在位点Ch02d12 杂合频率最高，表明供试材料在该位点的杂合性较为丰富。

3.3 聚类分析结果

从分子水平上来说，遗传相似系数越小，种质间的遗传分化越大，遗传多样性也越高。本研究中，26 份供试材料之间的Jaccard 相似系数分布在0.617 和1.000 之间，平均值达到了0.805。相似系数越大，表明所选品种间的遗传关系越近，遗传多态性偏低，遗传基础相对狭窄。

以相似系数0.617 为标准，可以明显分为2 个类群，类群I 为山定子组，只有一个种质（山定子）；类群II 为苹果组，包括除山定子以外的其他25 个苹果栽培品种。这一结果仅就山定子和其他苹果栽培品种来说，山定子和其他苹果组材料之间遗传相似系数相对较低，二者间亲缘关系相对较远，另一方面就遗传相似系数来说，数值越大表明亲缘关系越近。本研究结果在相似系数0.617 处分为2 个类群，也表明山定子和苹果组种质间的遗传分化不是太大。山定子为我国苹果生产中经常使用的野生苹果砧木，与苹果嫁接亲和性高，说明苹果栽培品种与山定子间嫁接亲和性的差异与遗传信息确实有关，从而可以在分子水平上解释为什么山定子被作为最为常用的苹果砧木的原因。

以相似系数0.680 为标准，苹果栽培品种分为5 类，II-1 组只包括舞美一个品种，其为芭蕾苹果的一种、苹果中的极矮化品种，是英国东茂林试验站从威赛克旭（McIntosh wijeik）自然实生苗中选育的柱型苹果，与其他普通型苹果之间亲缘关系相对较远；II-2 组只有祝光，其是美国古老品种之一、实生选种，早熟；II-3 组是蜜脆，其为美国品种，中熟，由Macoun×Honeygold 杂交选育而来。这一结果进一步证明，舞美、祝光和蜜脆与其他苹果栽培品种之间遗传距离相对较远。II-4 组包括其余的22 个苹果品种，在II-4 组中分为两大组，其中，II-4-1 组中以相似系数0.797 为标准，初秋、旭和王林聚在一起，初秋是从红玉和金冠的杂交种中选育而来的；旭原产于加拿大，实生选种；王林是从金冠实生苗中选育而来的。说明它们之间相对遗传距离较近。在相似系数0.781 处，千秋、秋红嘎拉、宫藤富士、长富1 号、北海道9 号、寒富、国光聚在一组，其中，千秋由东光（金冠×印度）×富士（国光×元帅）杂交而来；秋红嘎拉是嘎拉（（元帅×桔苹）×金冠）的芽变；宫藤富士、长富1 号、寒富都是富士（国光×元帅）芽变；北海道9 号是从富士（国光×元帅）×津轻的杂交后代中选育而来的，在这一组中富士系都聚在了一起。以相似系数0.836 为标准，红星、元帅、金矮生和青香蕉聚在一起，红星苹果为元帅的芽变品种；金矮生是金冠的短枝芽变；青香蕉由实生选育而来。上述品种中除旭和青香蕉之外都有元帅和金冠的血缘，亲缘关系相对较近，而旭和青香蕉都是古老品种，由实生选育而来，说明这2 个早期的苹果实生品种的来源很相近。II-4-2 组，在相似系数0.828 处，津轻、金冠、丹霞、乔纳金和秦冠聚为一组，其中，津轻为金冠的自然杂交种；丹霞是由金冠实生苗选育而来，乔纳金是金帅（金冠）×红玉的杂交种；秦冠是从金冠×鸡冠的杂交种中选育而来，在这一组中，津轻、丹霞、乔纳金和秦冠都含有金冠的血缘，从遗传学角度来说更多地保留了金冠的遗传特性。在相似系数0.750 处，红玉、锦玉和中秋聚在一起，红玉为可口香的实生后代，原产于美国；锦玉是红玉的芽变；中秋是红玉和元帅的杂交种，中秋更多保留了红玉的遗传特性；锦玉和中秋都含有红玉的血缘。因此，红玉、锦玉和中秋聚在了一起。

从聚类图中还可以看出，以相似系数1.000 为标准，金冠和丹霞聚在了一起，丹霞是从金冠实生苗选育而来的。这一结果也显示，二者之间的亲缘关系很近，基本不存在差异。如果想对这些材料进行区分只能增加引物数量，以进一步筛选二者间多态性的引物，寻找之间的差异。

本研究所用试材的大部分分类结果与已知苹果品种间的谱系较为一致，绝大部分系谱相同或相近的品种聚在一起，与HOKANSON 等[23]的试验结果相近。

4 结论

本研究以山定子和我国华北地区种植面积相对较大的25 份苹果栽培品种为供试材料，在进行分子鉴定的基础上，对供试材料进行了遗传多样性分析，同时建立了各供试材料的指纹图谱和分子身份证，在分子水平对山定子作为最常用苹果砧木进行了验证。该研究对于有效地利用和保护这些种质资源具有重要的参考价值，同时也提示育种者在育种工作中要尽量扩大选择范围，引入新的种质，促使种群间的基因交流和重组，以提高后代的品质。