改良QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定乌鸡肉中35种兽药残留

季宝成,杨澜瑞,程迎新,侯铸琛,吕 佳,许 旭,白艳红

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南 郑州 450001;2.河南省冷链食品安全质量安全控制重点实验室,河南 郑州 450001;3.冷链食品加工与安全控制教育部重点实验室(郑州轻工业大学),河南 郑州 450001 )

乌鸡肉中富含蛋白质、B族维生素等多种营养成分,且胆固醇和脂肪含量低,常被用于滋补养身,备受消费者青睐。在现代畜牧业中,兽药已被广泛用于预防和治疗疾病[1]。但随着市场需求的不断提升,兽药滥用现象逐渐增多,长期服用兽药残留超标的食品会对人体造成毒性作用、过敏反应等潜在的健康风险[2]。为保证食品安全以及人体健康,我国农业农村部、国家卫生健康委员会及国家市场监督管理总局于 2019 年9月联合发布《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留量》[3]。乌鸡肉中基质复杂且潜在的兽药种类繁多,因此,建立高效、简便的兽药多残留检测方法可以为食品安全提供技术保障及支持。

目前,常用的兽药多残留检测方法有荧光传感器法[4-7]、酶联免疫法[8]、质谱法[9-11]等。其中,质谱法具有高通量和高灵敏的优势,广泛用于动物源性食品兽药残留检测。液相色谱-质谱联用技术兼具液相色谱的高分离能力和质谱的高通量、高灵敏特征,逐渐发展成为动物源性食品兽药多残留的主要确证方法。根据检测需求,应用于兽药分析的液相色谱-质谱联用技术主要包括液相色谱-高分辨质谱法[12-13]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[14-17]。其中,LC-MS/MS法可用于靶向药物定性和定量分析,具有灵敏度高和选择性强等特点。尽管如此,利用液相色谱-质谱联用技术分析兽药多残留仍需对样品进行适当净化,以进一步降低样品基质对低残留浓度兽药的检测干扰。

乌鸡肉基质复杂,样品前处理可在一定程度上削弱基质效应,提升检测准确度和灵敏度。常用的样品前处理方法包括液-液萃取[18]、分散液-液微萃取[19]、固相萃取[20-21]和QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe)方法等。其中,QuEChERS具有快速、简单和高效的特点,广泛用于食品、生物医药以及环境等领域[22-24]。发展QuEChERS技术的关键在于新型高效基质净化材料的开发与应用,常规QuEChERS法多采用C18、PSA、GCB等微纳米材料作为基质吸附剂,其基质分离过程多依赖于高速离心,耗时相对较长,是主要的限速步骤。近年来,磁性纳米基质净化材料被开发并成功用于各种动物源性食品基质的净化过程[25-27],通过磁场辅助可在一定程度上提升基质分离过程的便捷性。然而,尺寸均一性、颗粒分散性等均是磁性纳米净化材料开发过程中的关键前提和注意事项[28-29]。

三聚氰胺海绵(MeS)具有高度交联的弹性三维多孔网络结构,性质稳定、吸附性好,通过简单的物理挤压即可去除溶液中的干扰基质,实现快速的基质分离过程。前期研究中,本课题组通过硅烷化反应制备了改性三聚氰胺海绵基质净化材料,与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术结合,成功用于鸡蛋中兽药多残留的快速分析,基质净化效果良好、操作简单[30]。

本研究拟采用还原氧化石墨烯改性(r-GO)三聚氰胺海绵(r-GO@MeS)作为基质净化材料,建立一种改良QuEChERS方法,结合UPLC-MS/MS技术快速检测乌鸡肉中兽药残留,以期为动物源性食品兽药多残留检测提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪:美国Agilent公司产品,配有二元泵、在线真空脱气机、自动进样器和柱温箱;Qtrap 5500质谱仪:美国Sciex公司产品,配有电喷雾离子源(ESI)和 MultiQuantTM3.0数据处理系统;Vortex-Genie2多功能旋涡混合器:美国Scientific Industries公司产品;3K15高速冷冻离心机:德国Sigma公司产品;0.22 μm有机微孔过滤膜针式过滤器:天津津腾实验设备有限公司产品;ME204分析天平:瑞士MettlerToledo公司产品。

1.2 材料与试剂

磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类标准品,乙酸铵(AA)、甲酸(FA)、乙酸(HAc)、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)、石墨化炭黑(GCB):上海安谱实验科技股份有限公司产品;乙腈(ACN)和甲醇(MeOH):色谱级,美国Thermo Fisher Scientific公司产品;乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、L(+)-抗坏血酸(LAA):分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司产品;单层氧化石墨烯(GO):苏州碳峰石墨科技有限公司产品;氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4):分析纯,天津市永大化学试剂有限公司产品;无水乙醇(EtOH):分析纯,天津市富宇精细化工有限公司产品;超纯水:由美国Millipore公司生产的超纯水机制备。

1.3 r-GO@MeS的合成

根据水热还原法制备还原氧化石墨烯改性三聚氰胺海绵[31]。称量0.05 g GO,加入100 mL蒸馏水,超声15 min,制备0.5 g/L GO分散液;然后称量50 mg LAA,倒入GO分散液,再次超声15 min;将裁剪好的圆柱形三聚氰胺海绵(直径8 mm,厚度3 mm,约0.15 cm3)浸入上述溶液中,充分挤压使分散液进入海绵,继续超声处理15 min后转移至密封玻璃瓶,放入烘箱,95 ℃水热反应3 h;反应完成后,将获得的海绵单体分别用蒸馏水和乙醇洗涤;最后将洗涤过的单体放入烘箱中,40 ℃干燥24 h,得到r-GO@MeS。

1.4 样品制备

将乌鸡切割、去骨、绞碎,保鲜袋密封,-20 ℃储存备用。精确称取2.5 g乌鸡肉样品于50 mL离心管,分别加入2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液、10 mL 0.5%HAc-ACN,涡旋5 min;向离心管中分别加入2.0 g Na2SO4、0.5 g NaCl,再次涡旋5 min,在4 ℃以8 000 r/min离心5 min;取1 mL上清液于2.0 mL离心管中,备用。将上清液吸取到装有5个r-GO@MeS的 2.5 mL注射筒中,动态吸打10次,然后经0.22 μm一次性针式过滤器过滤,上机待测。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18RRHD色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);流动相:A相为含有0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸铵的甲醇-水溶液(2∶98,V/V),B相为甲醇;梯度洗脱程序:0～2 min(0%B),2～10 min(0%～45%B),10～15 min(45%～98%B),15～17 min(98%B),17～17.1 min(98%～0%B),17.1～20.1 min(0%B);流速0.3 mL/min;进样体积2 μL;柱温35 ℃。

1.5.2质谱条件 ESI源,正离子模式,多重反应监测(MRM)模式。ESI源参数:雾化气流速3.0 L/min,干燥气流速10 L/min,加热气流速10 L/min,去溶剂气温度250 ℃,接口温度300 ℃,加热气温度400 ℃。使用MultiQuantTM3.0软件处理实验数据。

2 结果与讨论

2.1 改良QuEChERS法的优化

2.1.1提取条件优化 采用以下4种提取条件对比和考察脱水剂种类和Na2EDTA添加量对兽药回收率的影响:1) 提取剂(2.5 mL H2O和10 mL 1% HAc-ACN)/脱水剂(2.0 g无水Na2SO4和0.5 g NaCl);2) 提取剂(2.5 mL H2O和10 mL 1% HAc-ACN)/脱水剂(2.0 g无水MgSO4和0.5 g NaCl);3) 提取剂(2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1% HAc-ACN)/脱水剂(2.0 g无水Na2SO4和0.5 g NaCl);4) 提取剂(2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1% HAc-ACN)/脱水剂(2.0 g无水MgSO4和0.5 g NaCl)。

对以上4种条件下的兽药回收率进行比较分析,结果示于图1。可见,使用无水MgSO4作为脱水剂的(2)和(4)组中,恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、奥比沙星(ORB)等7种喹诺酮类药物的回收率低于60%,这可能是由于喹诺酮类兽药与镁离子发生螯合,导致提取液中兽药回收率偏低;而(1)组和(3)组提取条件下的回收率分别为78.6%～117.2%和89.1%～119.8%。其中,在提取条件(1)下,柱晶白霉素(KIT)的回收率低于80%(78.6%);在提取条件(3)下,其回收率升至89.1%,这可能与添加Na2EDTA的金属离子螯合作用相关。因此,选择2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 1%HAc-ACN作为提取剂,2.0 g无水Na2SO4和0.5 g NaCl作为脱水剂对待测样品进行提取。

图1 Na2EDTA和脱水剂对乌鸡肉中兽药回收率的影响Fig.1 Effect of Na2EDTA addition and dehydrating agents on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

此外,由于所考察的兽药中存在两性化合物,提取剂的酸碱性可能会对回收率产生影响。基于此,考察了不同含量HAc-ACN(乙酸占比分别为0%、0.5%、1%、3%、5%)对兽药回收率的影响,结果示于图2。可见,乙腈作为提取剂时,OFL、麻保沙星(MAR)、氟罗沙星(FLE)、西诺沙星(CIN)的回收率较低,分别为56.1%、47.3%、38.0%、53.4%。随着HAc含量增加,OFL、MAR、 FLE和CIN的回收率均增加至85%以上。除此之外,培氟沙星(PEF)的回收率随HAc含量增加呈上升趋势,而其他药物的回收率没有明显提高。通过计算得到,当乙酸占比分别为0.5%、1%、3%、5%时,所监测药物的总体平均回收率分别为96.7%、95.6%、95.2%、96.2%。当提取剂中乙酸占比为0.5%时,兽药回收率相对较高;当提取剂中乙酸含量较高(3%、5%)时,乌鸡肉样品出现部分结块现象。综上,采用2.5 mL 0.1 mmol/L Na2EDTA水溶液和10 mL 0.5%HAc-ACN作为提取溶剂。

图2 HAc添加对乌鸡肉中兽药回收率的影响Fig.2 Effect of HAc addition on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.1.2r-GO@MeS用量优化 样品经提取后,其溶液中含有脂肪、蛋白质、色素等干扰基质,净化剂的选择及其用量对基质净化效果有着重要影响。本实验分别使用3、4、5、6、7个海绵对1 mL乌鸡肉提取液进行基质净化(即海绵体积与提取液体积比分别为0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 cm3/mL),并考察r-GO@MeS不同用量对兽药回收率的影响(动态吸打5次),结果示于图3。可见,r-GO@MeS不同用量水平下,药物的回收率分别为73.9%～107.3%、74.7%～118.8%、80.6%～105.9%、76.1%～106.3%、72.9%～113.0%。通过对比回收率分布,当选用0.75 cm3/mL r-GO@MeS净化时,兽药回收率较集中,且35种药物回收率均处于80%～110%之间;当r-GO@MeS用量为0.45、0.60、0.90、1.05 cm3/mL时,分别有1种(KIT:73.9%)、1种(KIT:74.7%)、2种(PEF:79.3%、KIT:76.1%)、1种(KIT:72.9%)兽药的回收率低于80%。此外,当改性海绵用量较少(0.45、0.60 cm3/mL)时,部分化合物的回收率逐渐降至73.9%或者增至118.8%,表现为基质干扰效应加强,这可能与基质吸附不充分有关;当改性海绵用量较高(0.90、1.05 cm3/mL)时,所检测兽药的回收率整体呈降低趋势,这可能与过剩改性海绵与检测药物间的吸附作用有关。基于此,本研究通过阴性对照样品基质提取液加标实验,在0.75 cm3/mL料液比水平下考察改性海绵对药物的吸附效应。结果表明,磺胺类药物的回收率为95.3%～101.7%,喹诺酮和大环内酯类药物的回收率均处于80.2%～92.7%,说明r-GO@MeS对磺胺类药物基本无吸附,而对喹诺酮和大环内酯类药物具有一定程度的弱吸附作用。综上,药物的回收率不仅与样品基质的净化效果有关,还与净化材料之间的吸附作用有关。因此,选用0.75 cm3/mL r-GO@MeS进行实验。

图3 r-GO@MeS用量对乌鸡肉中兽药回收率的影响Fig.3 Effect of r-GO@MeS dosage on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.1.3净化模式优化 r-GO@MeS的净化模式可分为动态与静态2种。动态净化是通过反复抽推注射器栓塞实现提取液在海绵中不断吸附与分离,从而达到净化效果;静态净化是用注射器吸取提取液到r-GO@MeS中,通过调整静置时间达到净化效果。本研究通过控制吸打次数与静置时间设置以下6组净化条件:1) 动态吸打1次;2) 动态吸打5次;3) 动态吸打10次;4) 静置1 min;5) 静置5 min;6) 静置10 min,结果示于图4。对比实验结果可知,兽药回收率分别为72.9%～119.0%、74.3%～114.8%、76.1%～109.4%、64.9%～112.8%、68.6%～114.9%、61.9%～113.2%。在动态模式下,随着吸打次数的增加,兽药回收率更接近100%;且在动态吸打10次净化时,35种兽药的加标回收率均处于70%～110%之间,而动态吸打1次和5次时,分别有4种和5种兽药的回收率大于110%。静态模式下,当静置时间从1 min增加到10 min时,回收率处于90%以下的兽药数量增加,分别有31、29、24种兽药的回收率处于90%～110%之间,其中分别有1种(KIT:63.9%)、3种(PEF:68.7%、CIN:88.9%、KIT:77.8%)和5种(ENR:84.9%、OFL:84.2%、PEF:62.0%、CIN:87.1%、KIT:79.4%)兽药的回收率小于90%,这可能是由于静置时间较长,部分待测残留药物不同程度地被r-GO@MeS吸附。通过对比,以动态吸打10次作为净化条件时,35种兽药的回收率全部处于70%～110%之间,而静置1 min时,有31种兽药的回收率在70%～110%之间,表明动态吸打10次的基质净化效果更好,模式更优。因此,最优净化条件为0.75 cm3/mL r-GO@MeS、动态吸打10次。

2.1.4与商品吸附材料对比 本实验分别使用C18、PSA、GCB和r-GO@MeS对待测样品进行净化处理,其中,C18、PSA、GCB的用量均为25 g/L。通过对比兽药回收率,比较r-GO@MeS与上述商品基质吸附材料的净化效果,结果示于图5。对比发现,经GCB净化后,ENR、萘啶酸(NA)、氟甲喹(FLU)、PEF、噁喹酸(OXA)、CIN的回收率分别为48.0%、41.4%、56.3%、35.5%、36.6%、30.7%,均低于60%,且均为喹诺酮类兽药,由此推测,GCB对喹诺酮类药物具有一定的吸附作用。使用PSA、C18、r-GO@MeS处理后,兽药的回收率分别为69.0%～116.2%、75.5%～114.7%、73.8%～112.9%,除KIT外,其余兽药的回收率均处于80%～120%之间。从整体上看,使用r-GO@MeS净化后的兽药回收率更集中于100%,且有31种兽药的回收率处于90%～110%之间,而PSA、C18和GCB处理组分别有28、30和28种兽药的回收率处于90%～110%之间。经综合分析,r-GO@MeS与其他3种商品化吸附材料具有同等甚至更优的基质净化效果,在兽药多残留检测领域有着较大的发展潜力。

图5 不同吸附剂对乌鸡肉中兽药回收率的影响Fig.5 Effect of different purification adsorbents on the recoveries of veterinary drugs in black chicken

2.2 r-GO@MeS材料表征

三聚氰胺海绵基底呈白色,经还原氧化石墨烯改性后,其颜色变成深黑色。使用扫描电子显微镜(SEM)观察发现,改性前后其表面微观形貌发生了显著变化。MeS和r-GO@MeS均由纤维骨架相互连接而成,呈多孔网络结构。但MeS表面光滑,无附着,示于图6a、6b;r-GO@MeS的微观结构中存在还原氧化石墨烯片层,示于图6c、6d,并通过平铺堆叠和延伸2种方式大量附着于骨架表面和边缘。采用乙腈、甲醇等常用有机溶剂反复挤压、浸泡,测试其溶液稳定性,结果表明,r-GO@MeS材料弹性良好,且未发现有石墨烯片层脱落的现象。

图6 MeS(a, b)和r-GO@MeS(c, d)的扫描电镜图Fig.6 SEM spectra of MeS (a, b) and r-GO@MeS (c, d)

2.3 质谱条件优化

采用MRM模式对乌鸡肉中的兽药残留进行定性、定量分析。首先,在Full scans模式下将各标准溶液依次注入质谱中,获得相应的母离子;然后,母离子经碰撞诱导解离(CID)获得碎片离子,选择其中强度最高的2个子离子分别作为定量和定性离子。优化后,被测兽药的MRM详细参数列于表1。

表1 UPLC-MS/MS检测乌鸡肉中35种兽药残留的MRM参数Table 1 MRM parameters of 35 veterinary drug residues in black chicken by UPLC-MS/MS

2.4 方法确认

本研究考察了方法的选择性、基质效应(matrix effect, ME)、准确性、精密度、线性关系、检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果列于表2。使用优化的提取与净化方法处理阴性对照样品,经UPLC-MS/MS检测后未发现存在基质干扰峰;而经基质加标后,所检测的35种兽药均出现相应的色谱峰,表明该方法具有良好的选择性。使用UPLC-MS/MS检测样品时,待测溶液中共存的干扰基质在电喷雾离子化过程中可能对目标化合物产生离子增强或抑制作用,称为基质效应。基质效应的计算公式为:

(1)

式中,ka表示基质匹配曲线的斜率,kb表示溶剂校正曲线的斜率。当ME在±20%以内时,基质效应不显著;当ME超过±20%时,存在明显的基质增强或抑制作用。从表2可知,所有被检测药物的基质效应均处于-19.4%～19.8%之间,表明r-GO@MeS对乌鸡肉样品具有较好的基质净化效果。

为考察定量检测结果的准确性,分别在低、中、高(50、100、150 μg/kg)3个加标水平下进行定量分析,所监测兽药的回收率分别为73.0%～114.5%、78.7%～112.6%、66.6%～118.8%,均处于60%～120%之间。相比之下,在高浓度加标水平下,磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、氟罗沙星、西诺沙星、交沙霉素、柱晶白霉素等兽药的回收率降低,这可能与基质净化材料的弱吸附作用有关。

通过35种兽药的日内、日间重复性实验考察方法的精密度,其分别不超过13.8%和14.6%,表明该方法具有良好的精密度,在乌鸡肉兽药多残留分析中有着良好的适用性。

在5～200 μg/kg浓度范围内,以待测样品中兽药浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线,相关系数(R2)均大于0.998,表明该方法具有良好的线性关系。分别用3倍和10倍信噪比(S/N)确定LOD和LOQ,除磺胺胍(SGD)的LOD(6 μg/kg)与LOQ(15 μg/kg)偏高外,其余34种兽药的LOD范围为0.1～1.8 μg/kg,LOQ范围为0.3～5 μg/kg,表明该方法的灵敏度较高,能够对低于最大残留限量的兽药目标物进行准确分析。

2.5 实际样品检测

利用本方法对24个市售乌鸡肉样本中的35种兽药进行检测分析,仅在其中1份阳性样品中检测出磺胺二甲基嘧啶(SM2),残留浓度低于定量限。

3 结论

本研究建立了一种基于r-GO@MeS的改良QuEChERS方法,结合UPLC-MS/MS测定乌鸡肉中35种兽药残留,仅需简单的“吸附-挤压”动态循环过程即可实现对复杂基质的高效快速净化。方法学考察结果表明,该方法的检出限低、灵敏度高、线性关系好,具有良好的准确性和重现性。此外,r-GO@MeS净化材料的制备过程简单、成本低,具有与C18、PSA、GCB商品化吸附材料同等甚至更优的基质净化效果。作为一种新型的基质净化材料,r-GO@MeS在复杂基质净化领域具有良好的发展前景和应用潜力。