密胺制品水解产物的液相色谱-质谱分析及迁移研究

熊小婷,饶 璞,陈意光,郭燕华,宋梓锋,李慧勇,黄晓钢,何国山

(广州质量监督检测研究院,国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东 广州 511447)

三聚氰胺-甲醛(简称“密胺”)餐具具有轻巧、美观、不易碎裂等优点,在餐饮和儿童用品行业深受欢迎,2021年密胺餐具全球市场规模已达到7.56亿美元[1-4]。合格的密胺餐具在常温非酸性条件下较稳定,但是在酸性、高温长期使用等苛刻条件下,三聚氰胺-甲醛树脂可发生水解,释放出甲醛、三聚氰胺及其他化学成分,存在危害人体健康的风险[5-8]。

目前,关于密胺餐具中三聚氰胺、三聚氰胺酸转化产物的迁移量检测方法和迁移规律的研究已有报道,主要采用高效液相色谱法、高效液相色谱-串联四极杆质谱法[9-10],且均为特定目标物的靶向检测。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF MS)及其配套软件、数据库,可以非靶向地获取和分析样品中大量成分的精确分子质量、碎片离子、色谱保留时间、色谱峰形、相对含量等信息[11],广泛用于食品非法添加、产品鉴别、食品接触材料风险物质筛查等方面[12-14],但尚未见非靶向筛查密胺制品水解产物及其迁移情况的报道。

本工作拟采用UPLC-QTOF MS结合三聚氰胺-甲醛树脂的合成原理、化学结构碎片分析软件,研究食品接触密胺制品在酸性溶液中的高温水解产物,以及水解产物在密胺餐具酸性迁移液中的迁移情况,希望为密胺制品毒理学研究和食品安全风险监测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Aquity UPLC H-Class Plus超高效液相色谱仪:美国Waters公司产品;X500B四极杆飞行时间质谱仪:美国SCIEX公司产品,配有电喷雾离子源(ESI)及SCIEX OS集成软件(3.0.0.3339版);Milli-Q IQ7000超纯水器:美国Millipore公司产品;SECURA225D-1CN、BSA224S分析天平:德国Sartorius公司产品;25 mL水热反应釜:内罐材质为聚四氟乙烯。

1.2 主要材料与试剂

三聚氰胺标准品(纯度99.8%)、甲酸(色谱纯):上海安谱实验科技公司产品;甲醇、乙腈(色谱纯):上海麦克林生化科技公司产品;浓盐酸(优级纯)、乙酸(分析纯)、乙酸铵(分析纯):广州化学试剂厂产品;实验用水为超纯水。

密胺树脂:广东顺德恒业公司产品;16批次密胺餐具:购自广州市场。

1.3 溶液配制

准确称取5 mg三聚氰胺标准品于10 mL容量瓶中,用水定容、混匀,配制500 mg/L标准储备溶液,于-20 ℃下保存。

移取0.2 mL标准储备液于10 mL容量瓶中,用水定容、混匀,配制10 mg/L标准中间溶液,于4 ℃下保存。

移取0.2 mL标准中间液于10 mL容量瓶中,用水定容、混匀,配制200 μg/L标准中间溶液1,于4 ℃下保存。

分别移取1、0.2 mL标准中间液,2.5、0.5、0.25 mL标准中间液1于10 mL容量瓶中,用水定容、混匀,配制标准工作液,现配现用。

盐酸溶液:移取10 mL浓盐酸于1 L容量瓶中,用水定容、混匀。

5 mmol/L乙酸铵:称取0.385 g乙酸铵于烧杯中,用1 L水溶解、混匀,过滤后使用。

4%乙酸溶液(体积分数):量取20.0 mL乙酸,加入480 mL水,混匀。

1.4 样品处理

密胺制品:称取5.00 g密胺树脂于内衬锡纸的50 mL烧杯中,用不锈钢片压实,将锡纸包裹好。将烧杯置于130 ℃烘箱中,放置1 h,取出样品冷却至室温。该样品为自制密胺制品。

用于水解的密胺制品粉末的制备:用电钻分别钻取自制密胺制品及16批次密胺餐具,获得密胺制品粉末。

密胺制品粉末水解溶液的制备:分别称取0.06 g密胺制品粉末于2 mL塑料离心管中,用4.5 mL盐酸溶液分3次洗涤,弃去洗液;再用4.5 mL盐酸溶液将粉末全部转移至25 mL水热反应釜聚四氟乙烯内罐中,封罐;将水热反应釜置于110 ℃烘箱中,放置(60±5) min;取出,冷却至室温,开罐,将罐中的粉末和液体全部转移至100 mL比色管中,用水洗涤罐内壁,将洗涤液转移至同一比色管中,用水定容到刻度,涡旋混匀;取约1 mL溶液过聚醚砜滤膜,待测。

密胺餐具迁移实验:对16批次密胺餐具中的10批次进行迁移实验,每批次样品均按采用4%(体积分数)乙酸在100 ℃下浸泡0.5 h和4%(体积分数)乙酸在40 ℃下浸泡24 h这2个条件进行实验。考虑到样品均为可重复使用,参考迁移试验通则GB31604.1—2015《食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则》中的相关要求,本研究用于测试的样品溶液均为第3次迁移液,即将样品用新鲜模拟液按浸泡条件重复浸泡3次,取第3次浸泡液用于研究。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 月旭Ultimate HILIC amide色谱柱(100 mm×2.1 mm×5 μm);流动相:5 mmol/L乙酸铵(A)-乙腈(B);梯度洗脱:0～1.0 min(10%A),1.0～6.0 min(10%～30%A),6.0～10.0 min(30%A),10.0～11.0 min(30%～10%A),11.0～15.5 min(10%A);流速0.40 mL/min;柱温为室温;进样量2 μL。

1.5.2质谱条件 电喷雾离子源正离子(ESI+)模式,信息相关扫描方式(IDA),喷雾电压3 500 V,喷雾气压强414 kPa,辅助加热气压强414 kPa,气帘气压强276 kPa,温度650 ℃,碰撞气压强48 kPa。TOF MS条件:质量扫描范围m/z50～1 000,采集时间0.3 s, 去簇电压(DP)60 V,碰撞能10 V。TOF MS/MS条件:质量扫描范围m/z50～1 000,采集时间0.1 s,去簇电压60 V,碰撞能20 V。

采用SCIEX OS软件的Analytical模块自动提取色谱峰,Explorer模块手动提取色谱峰,质量提取窗口0.04 u。Explorer模块的“Formula Finder”功能用于分子式检索,“Fragments pane”功能用于推测离子碎片的化学结构以验证解析结果。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

密胺制品的预期水解产物主要为含氨基、羟基的强极性成分,采用常见的C18、C8反相色谱柱会导致水解产物在色谱柱上没有保留,均在色谱柱死时间附近出峰,无法通过保留时间、色谱峰形等条件分析化学成分,且各成分及其裂解质谱峰可能相互干扰,从而导致错误判断。参考文献[15],采用氨基柱(亲水性柱、HILIC)进行色谱分离,以增强水解成分的色谱保留;在水相中添加乙酸铵,以提高方法的稳定性,改善色谱峰形。经流动相梯度洗脱条件优化后,三聚氰胺的保留良好,保留时间为2.3 min(在0.4 mL/min流速下,色谱柱的死时间约为0.6 min),且洗脱程序在较强的洗脱条件下(30%水相)保持4 min,以使保留较强的成分被洗脱,获得尽量多的成分信息。

根据仪器的溶剂流速-气体流速-气体温度推荐参数(当化合物性质稳定时,轻微改变推荐离子源参数不会对化合物的响应产生显著影响,在非靶向筛查时,通常采用推荐离子源参数)设置质谱离子源条件。采用单去簇电压(DP spread=0)、单碰撞能(CE spread=0)参数设置,降低1次采集循环采集的谱图数,增加单张质谱图的采集时间,提高质量稳定性。

参考文献[16-18],采用盐酸这一较为常见的氨基树脂水解促进剂,在可预期的最严苛条件下对样品进行水解,最终水解液中仍存在大量粉末,只有少部分样品发生水解,但已经能够反映产品在极端严苛条件下的水解情况。

2.2 质量误差和三聚氰胺工作曲线

由于密胺制品的预期水解产物为含三聚氰胺结构的化学成分,因此采用三聚氰胺作为数据采集质量稳定性的质控物质。在1.5节条件下,序列中三聚氰胺准分子离子峰质荷比测量值与理论值的示值相对误差均小于5×10-6。

2.3 水解溶液中化合物的鉴定

根据所提取色谱峰的精确相对分子质量推测分子式,根据密胺制品的合成原理推测化学结构[3,9,19],再用SCIEX OS Fragment pane(FP)功能结合化学成分的二级质谱碎片验证化学结构的合理性。

由于三聚氰胺环结构是相对稳定的共轭结构,三聚氰胺-甲醛树脂固化后主要形成以>N—CH2—N<和>N—CH2—O—CH2—N<桥联键(还可能有—NH—桥联键)连接的三聚氰胺环[20-21]。理论上,酸水解反应会发生在桥联键上,产生三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛衍生物,三聚氰胺-甲醛衍生物可进一步水解产生三聚氰胺,三聚氰胺上的胺基可生成羟基取代衍生物。三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片离子有m/z127.07、139.07、151.07、163.07、169.08、181.08、277.14、289.14等,示于图1。当水解成分中含有这些特征碎片离子时,可推断为三聚氰胺-甲醛寡聚物。通过水解成分分子式中的氮原子数可以推断寡聚物中的三聚氰胺环数(每个三聚氰胺环含6个氮原子)。分子式中的碳原子数-3×三聚氰胺环数=结构中的亚甲基数,以此推断三聚氰胺-甲醛寡聚物可能的化学结构。部分检出成分可能的化学结构示于图2。如,成分8、9为含有2个三聚氰胺环、2个亚甲基和1个氧原子的同分异构体;成分8存在m/z277.14[M+H-H2O]+碎片离子,可见结构中存在1个羟甲基;成分9只有m/z127.07、139.07碎片离子,结构中不存在羟甲基,而是2个三聚氰胺环通过醚键相连。

注:图中质子加和位置和正电荷所在位置未经验证图1 三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片离子Fig.1 Characteristic fragment ions of melamine, melamine-formaldehyde oligomer and its fromaldehyde derivatives

图2 部分检出成分可能的化学结构Fig.2 Possible chemical structures of some components detected in hydrolysis solutions of melamine-formaldehyde products

三聚氰胺的特征碎片离子有m/z85.05[M+H-42]、68.02[M+H-59]、60.06、110.05[M+H-17]。成分41的准分子离子为m/z112.061[C3H5N5+H]+,特征碎片离子为m/z70.04[M+H-42]和68.02,与三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片离子,且分子式比三聚氰胺少NH,推测为2,4-二氨基-1,3,5-三嗪。成分42的分子式C3H5N5O及特征碎片离子为m/z86.04[M+H-42]、69.01[M+H-59],与文献[9,15]相同,推测为三聚氰酸二酰胺。成分43的特征碎片离子有m/z85.05[M+H-56]、99.07[M+H-42]、82.04[M+H-59]、60.06,与三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片离子,且分子式比三聚氰胺增加CH2,推测为甲基三聚氰胺。成分44的特征碎片离子有m/z100.05[M+H-42]、86.04[M+H-56]、83.02[M+H-59],与成分42具有相似的裂解方式,且分子式增加CH2。成分45的特征碎片离子有m/z127.07[M+H-43]、153.05[M+H-17]、85.05、110.05,且分子式比三聚氰胺多CHNO。成分46的特征碎片离子有m/z153.09[M+H-18]、141.09[M+H-30]、124.06[M+H-47],与成分2具有相似的裂解方式,且分子式比成分2多CH2。成分47的分子式由2个三聚氰胺环脱去1个NH3,表明密胺树脂固化后存在由氮原子直接桥联2个三聚氰胺环,主要的碎片离子并未有单一的三聚氰胺环,通过氮原子直接桥联的2个三聚氰胺环结合得更紧密。成分48的分子式为C22H44N6O9,准分子离子峰为[M+NH4]+,且存在较弱的m/z89.06、133.09、177.11、221.14、265.16等典型的聚乙二醇碎片离子。成分49～53与成分48类似,成分48～53分子式依次增加C2H4O。成分55的分子式及特征碎片离子与文献[22]报道一致,推测为三乙醇胺。成分56的分子式为C8H19NO4,比三乙醇胺增加C2H4O,特征碎片离子为m/z150.11[M+H-C2H4O]、132.10[M+H-C2H4O-H2O]、 114.09、88.08、70.07,与三乙醇胺相同,推测为三乙醇胺单乙二醇醚。成分57的分子式为C10H23NO5,比三乙醇胺增加2个C2H4O,特征碎片离子为m/z220.155[M+H-H2O]、176.13[M+H-H2O-C2H4O]、132.10、114.09,推测为三乙醇胺双乙二醇醚。成分54的分子式为C5H13NO2,特征碎片离子为m/z102[M-H2O]、58[M-H2O-C2H4O],与三乙醇胺类似,推测为N-甲基二乙醇胺。成分58～61未检测到明显的子离子碎片,推测母离子为[M+Na]+,各成分分子式依次增加C5H8O4(精确相对分子质量132.042 u),且相对分子质量最小的成分为C10H18O9,推测均为C5H10O5的脱水缩合物,属于多糖醇,具体结构未明确,其提取离子色谱图示于图3。

图3 成分58～61的提取离子色谱图Fig.3 Extraction ion chromatogram of component 58-61

在17份密胺制品的水解溶液中发现61种化学成分,包括1种三聚氰胺(成分1),5种三聚氰胺-甲醛衍生物(成分2～6),33种三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物(成分8～14、16～22、24～31、33～39),7种三聚氰胺结构类似物(成分41～47),6种三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物(成分48～53),4种乙醇胺类(成分54～57),4种多糖醇类(成分58～61)。各成分的精确分子质量、分子式、二级碎片离子、保留时间等信息列于表1。

表1中,碎片离子采用相对丰度由高到低排列,大部分碎片离子可通过FP提供的裂解方式解释。理论上,成分3应为三聚氰胺的同一氮原子二羟甲基衍生物,但FP功能无法计算解释m/z139.073碎片离子。成分3和4的提取离子色谱图示于图4,质谱图示于图5。含羟甲基的三聚氰胺甲醛寡聚物可以同时存在[M+H]+和[M+H-H2O]+准分子离子峰,且可能[M+H-H2O]+响应更高,可检测到的三聚氰胺-甲醛低聚物最多含有6个三聚氰胺环。

图4 成分3和4的提取离子色谱图Fig.4 Extraction ion chromatogram of component 3 and 4

图5 成分3(a)和4(b)的二级质谱图Fig.5 Mass spectra of fragment ions of component 3 (a) and 4 (b)

在一定条件下,三聚氰胺的胺基会逐步被羟基取代,生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸[9]。在本实验条件下,只检出三聚氰酸二酰胺(成分42)。

成分43、45、46是三聚氰胺的甲基取代衍生物及其酸解产物和羟甲基化产物,目前未见密胺制品中存在该类化合物或者以三聚氰胺的甲基取代衍生物为起始物质合成密胺-甲醛树脂的报道。GB 9685—2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》未列入三聚氰胺甲基衍生物,该类成分的来源有待进一步研究。

成分48～53为三聚氰胺的聚乙二醇衍生物,推测为密胺树脂中添加了聚乙二醇[3-4],且聚乙二醇可与羟甲基三聚氰胺成醚。

成分54～57为三乙醇胺及其相关化合物。三乙醇胺是密胺树脂合成添加剂之一,主要用于调节体系酸碱性[18]。

2.4 密胺餐具迁移液测试结果

10批次密胺餐具的迁移测试结果列于表2。除三聚氰胺及表2中的8种成分(1种三聚氰胺-甲醛衍生物、1种三聚氰胺-甲醛寡聚物、4种三聚氰胺结构类似物、2种乙醇胺类)外,其他成分均未检出。大部分批次样品在高温(100 ℃)条件下的检出量高于长时间(24 h)条件,同一化学成分在不同检出批次的检出量差别可达10倍以上。

表2 密胺餐具迁移液中测得的水解成分Table 2 Hydrolyzate detected in migration solution from 10 melamine-formaldehyde tableware samples

2.5 水解成分的安全性

三乙醇胺在多种食品接触材料中的特定迁移限量为0.05 mg/kg[22],重复摄入三乙醇胺会对生命体产生肝、肾损伤。在有机小分子生物活性数据库网站(Pub Chem,网址:https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Toxtree平台(网址:http:∥toxtree.sf.net/predict)检索和预测成分2、7、41、42、43、45毒性。Pub Chem数据库可检索到:成分42能够导致视网膜退化,成分43小鼠腹腔注射半数致死量为270 mg/kg,成分45存在急性毒性(Acute Tox. 4)、皮肤刺激(Skin Irrit. 2)和眼刺激(Eye Irrit. 2A)的危害,其他成分尚未有毒性数据。Toxtree平台无法对上述6种成分进行分类和毒性预测。

Toxtree无法预测三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的毒性数据,但相关成分在胃酸条件下均可进一步水解产生甲醛和三聚氰胺,其毒性不可忽略。

3 结论

本研究在密胺制品酸性高温水解溶液中检出61种成分,包括三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺结构类似物、三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物、乙醇胺类、多糖醇类等。部分成分可在密胺餐具的酸性食品模拟物中迁出,且不同样品的检出量存在较大差异。这些可迁出成分存在潜在的食品安全风险,有待进一步研究。