数字离子阱偶极直流激励解离技术研究

周文兴,黄 刚,蔡红华,刘俊杰,邓一兵,杨清宇,王伟民,徐福兴,丁传凡

(1.西安交通大学电信学部自动化科学与工程学院,陕西 西安 710049;2.中国航天员科研训练中心,北京 100094;3.中国载人航天工程办公室,北京 100034;4.宁波大学材料科学与化学工程学院,浙江省先进质谱技术与分子检测重点实验室,浙江 宁波 315211 )

碎片离子检测技术的发展对质谱仪器发展和物质鉴定具有重要意义[1-2]。碎片离子的裂解和检测主要通过串联质谱(MS/MS或MSn)实现,能够提供较高的灵敏度和选择性[3]。传统的MS/MS是在空间串联质谱仪上进行的,如三重四极杆和多扇区质谱仪[4];而时间串联质谱是在单个质量分析器上依次进行MS/MS,如离子阱质谱(ion trap mass spectrometry, ITMS)和傅里叶变换质谱[5]。目前,已经出现了20多种碎裂技术[6]。碰撞诱导解离(collision induced dissociation, CID)具有简单和易于使用等优点,是MS/MS实验中最常用的技术,也是很多商业仪器的基本碎裂模式。CID的原理是将经质量选择的前体离子激发到高动能,然后通过与中性分子(如氦气或氩气)的多次碰撞而破碎,从而将离子的动能转化为内能。当离子的内能超过解离途径的临界解离能时,该离子会解离成多个碎片离子[7]。

ITMS中的CID过程一般由几个时间序列完成,包括经质量选择的前体离子分离、离子激发、离子-分子碰撞和离子解离[8-9]。随着技术进步,ITMS中的CID过程更灵活。例如,根据质量分析器的不同,ITMS主要分为圆柱形、矩形和环形[10-11];根据驱动电压的不同,ITMS可分为振幅扫描型、频率扫描型[12]和静电型[13]。另外,ITMS同时具有结构简单、体积小、对精度和真空度要求低等特点,是小型化质谱领域首选的质谱仪之一。近年来,ITMS在航天航空领域显示出重要地位。然而,ITMS的CID过程存在由于共振激发原理导致的弱碎裂率或低质量截断(low mass cutoff, LMCO)现象[6,14],使碎片离子检测的灵敏度低。在ITMS中,CID过程通常是通过在主射频电压上叠加1个较小的辅助交流电压(AC)来实现的。当AC频率接近或等于隔离离子的久期频率时,离子会发生共振激励,进而导致离子动能的剧烈增加。其后,高动能的离子与背景气体碰撞,从而将动能转换为离子内能。最终,当离子内能大于某个化学键断裂路径的势垒后,将会形成一系列碎片离子。很显然,在CID过程中,离子需要获得足够的动能才能有效碎裂成碎片离子。

过去几十年,通过在ITMS中增加离子动能提高碎裂效率的技术得到发展。例如,热辅助碰撞诱导解离(thermally-assisted collision-induced dissociation, TA-CID)技术可以通过加热背景气体提高前体离子的碎裂效率[15]。研究表明[16-17],增加背景气体的质量或提高气压也可以提高碎裂效率。此外,还出现了一些新型裂解技术,例如红外多光子裂解、真空紫外裂解、电子捕获解离和电子转移裂解等[6]。偶极直流激励(dipolar direct current (DC) excitation, DDC)可以用于提高CID的效率,本质上是将离子移动到理论稳定性图的边界进行CID。1992年,Paradisi等[18]首次在四极离子阱中展示了在稳定性边界进行CID的结果,证明了稳定性图中离子阱通过马修方程计算的特征参数a和q均对碎裂效率有影响。Cooks等[19]使用毫秒级的直流脉冲增加离子动能,提高了正丁基分子的CID效率,并通过模拟证明了DDC会改变离子阱的稳定性图。March等[20]研究了在四极场中通过控制偶极直流来影响CID的效率,认为DDC会导致离子偏离阱的中心,从而进入更靠近电极、更强的四极电场区域,因此离子可以更快地获得更多动能。Richard等[21-22]总结了DDC的原理和过程,即离子通过1个具有交替正负极性的偏转直流电场区域会偏离阱的中心,使运动速率加快,最终导致离子内能显著提高而发生解离。McLuckey课题组[23]开展了一系列应用DDC技术的研究,发现离子的存储效率、分辨率、离子隔离效率、离子分子反应、离子激活效率等性能都会得到改善。使用DDC-CID技术要求有1个额外的直流电源用于提供直流电压,需要通过改造电路实现偶极直流施加方式,同时偶极直流电压具有时序变化且需要精确控制,故对仪器的硬件部分要求很严苛。

频率扫描离子阱质谱具有射频电压低、不易放电、质量范围宽等优势,但电路结构较复杂。数字离子阱中使用的脉冲开关和方波电压很好地解决了频率扫描离子阱的电路设计问题。目前,已有关于使用数字离子阱进行CID实验的报道,如在固定频率下进行共振激励,或者改变占空比的共振激励[24-25]。改变占空比易于实现直流分量的引入,因此,将其应用于线形离子阱的CID实验可以简化过程。

本研究拟通过改变数字离子阱的占空比进行DDC-CID实验。偶极激活仍施加于离子阱质量分析器的x方向,同时,通过改变数字方波占空比,分别在x和y方向电极上获得不同的直流分量,使用软件模拟的方法证明稳定性图的改变。

1 实验部分

1.1 数字波形产生直流的原理

占空比d定义为1个周期内高电平与低电平的时间比例。当数字波形的占空比偏离50%时,会在离子阱中心产生直流偏置。假设通过高速开关控制的方波电压的高电平、低电平分别为V1、V2,当占空比为50%时,离子阱中产生的直流分量可以用图1表示。直流(DC)、射频(RF)电压分别对应马修方程的U和V,可通过射频电压的正高压V1和负高压V2计算得到,示于式(1)和(2):

注:T是波形的周期;t是高电平持续时间;占空比d=t/T图1 数字方波占空比示意图Fig.1 Schematic diagram of the rectangular waveform voltage

U=dV1+(1-d)V2

(1)

V=2(V1-V2)(1-d)

(2)

V1和V2幅值相同,但相位相反,所以U和d之间的关系可以表示为:

U=(2d-1)V1

(3)

显然,当占空比偏离50%时,可以产生1个正的直流电压或1个负的直流电压。在这种使用1个线性离子阱质量分析器的情况下,式(1)中的U和V一般定义为x方向电极上的直流或交流分量,而y方向的数值相同、相位相反。

1.2 仪器平台

所有实验均在实验室自行搭建的三阶真空差分的离子阱质谱平台上完成[26]。使用自制的双曲面线形离子阱作为质量分析器(x0=5.0 mm,y0=5.0 mm,z0=50.2 mm),其径向横截面的上、下电极加载有频率可以线性扫描的主射频电压,电压幅值恒定为150 Vp-p,频率1.0 MHz,左右电极上加载有反相的辅助共振(AC)电压,频率为主频的分频,AC频率可以通过离子阱的稳定性系数β计算得到,且扫描幅值设置为0.6～1.2 V,详细的仪器参数列于表1。氦气作为背景气体,气压控制在1×10-3Pa,在CID阶段,可以通过针阀调节气压到5×10-3～8×10-3Pa。按质量从小到大,从离子阱中弹出的离子可以被打拿极电子倍增器(CEM 4879, Burle/Photonis, Lancaster, PA,USA)检测到。检测器位于离子阱的径向,加载有恒定的负高压,电子倍增器电压为-1 100 V,打拿极电压为-3 500 V。

表1 离子阱质谱仪的仪器参数和模拟软件条件设置Table 1 Main instrument parameters of ion trap mass spectrometer and settings in the software

双曲面离子阱质量分析器的示意图示于图2,其使用数字方波驱动。x和y方向的数字方波幅值相等,相位相反。以图2a为例,当x方向电极上产生U的直流分量,y方向会产生-U的直流分量;当x方向电极分别为10%和90%时,y方向2个电极占空比分别为-10%和-90%。在实验过程中,除了CID阶段,其他阶段的占空比均固定设置为50%。母离子的隔离是通过数字非对称波形隔离(digital asymmetric wave isolation, DAWI)来实现的,也是通过改变占空比实现特定的功能[27]。在CID过程中,共振激励仍添加在x方向。与此同时,通过改变占空比引入偶极直流激励,进一步提高了离子的碎裂效率。离子阱的稳定性系数β调整为1/3,因此AC分频数为6。数字离子阱质谱中,分频数和离子阱稳定性系数β、q之间的关系列于表2。实验时序示于图2b,整个CID的时长为20 ms。

表2 数字离子阱中分频数n,稳定性系数β和qTable 2 Frequency division rate n, stability parameters β and q in digital ITMS

图2 双曲面离子阱加载数字方波(a)和实验时序(b)的示意图Fig.2 Schematics of the electric circuit of the digital ion trap (a) and the experimental timing sequence (b)

1.3 实验样品

利血平(分子质量608 u):上海Aladdin生物有限公司产品。将利血平标准样品溶解于甲醇-水(50∶50,V/V,1%甲酸)溶剂,配制成5×10-5mol/L标准溶液,使用微量注射泵(TSP100200, Polymicro Technologies, L.L.C, Phoenix, AZ, USA)以1 μL/min流速注入ESI毛细管,毛细管内径100 μm,电喷雾高压4.0 kV。

1.4 软件拟合平台和方法

使用最新的SIMION-2020软件进行离子轨迹拟合,大大加速了离子轨迹运算和电场计算的速度,擅长并行计算解决多目标优化等复杂的电场理论计算等问题[26]。以质子化的利血平(m/z609) 为拟合对象,8×10-3Pa的氦气气压作为背景气体嵌入硬球碰撞模型。离子飞行时间、离子位置、离子动能等参数可以导入1个列表存储,自动计算久期频率、直流电压,相关的模拟参数列于表2。SIMION模拟相关参数在CID过程中的变化示于图3。截取一段时间内x和y方向电极上的电压变化曲线,在开始的10 μs内,占空比保持50%不变,其后占空比调整为30%。对于x方向,在1个周期内,高电平、低电平比例分别为0.3、0.7,而y方向相反。

注:a.双曲面离子阱内形成的四极电场;b.x和y方向数字方波的变化,幅值固定为150 V0-p图3 拟合相关结果Fig.3 Related results of simulation

2 结果与讨论

选用利血平为实验样品,加载在x电极对上的方波电压信号占空比分别为51.562 5%、52.343 7%、53.125 0%、50%、48.437 5%、47.656 3%、46.875 0%。根据式(3)可计算出其占空比比例所对应的x和y方向电极的偏置直流电压,结果列于表3。4种不同占空比的碰撞解离实验结果示于图4。根据理论计算可知,离子在偏置直流电压的作用下,x方向的运动动能受到很大影响。实验发现,在偏置直流电压驱动下的碰撞诱导解离中,数字方波频率受到影响。在解离过程中,当加载在x方向的偏置直流电压不同时,所对应的方波频率也不同,其射频频率值列于表3。结合理论计算及实验数据可以看出,在x电极上占空比为53.125 0%时,即x电极上偏置直流电压值为+9.375 0 V时,离子的解离效率达到最高,为80.2%。这是由于正偏置直流电压的作用提高了离子的运动动能,解离时的方波频率越来越高,同时增加了离子与中性气体分子发生碰撞的次数,母离子获得的内能增加。反之,当x电极上占空比为46.875 0%,即x电极上偏置直流电压值为-9.375 0 V时,离子的解离效率最低。这是由于在负偏置直流电压的作用下,离子在x方向的运动动能减少,离子解离时的方波频率越来越低,同时降低了离子与中性气体分子发生碰撞的次数,母离子获得的内能减少,甚至母离子不会发生解离。随着负偏置直流电压越来越大,在解离过程中,方波频率越来越低。图4中相应的质谱峰结果列于表4。

表3 DDC-CID实验参数Table 3 Experimental parameters of DDC-CID

表4 图4中质谱峰结果Table 4 Mass spectra peaks identifications for Figure 4

图4 4个偶极直流驱动CID谱图Fig.4 Four experimental mass spectra by DDC-CID

质谱图中的碎裂效率(EF)为所有产物离子的丰度之和除以产物离子与母离子丰度之和,示于式(4)。式中,∑Fi表示所有产物离子丰度之和,P表示母离子丰度。

CID过程中离子的捕获效率定义为母离子与子离子强度之和除以初始母离子的强度,示于式(5)。

根据表2中的解离效率可以判断,当占空比为53.125 0%时具有最高的碎裂效率,同时碎片离子m/z365的相对丰度最高。由表4可以观察到利血平的主要质谱峰,但没有观察到m/z174(C11H12NO+),195(C10H11O4+)和236(C13H18NO3+)处的质谱峰,可能是由于离子阱的低质量截止导致的。使用DDC-CID技术可以使利血平低质量碎片离子的捕获效率提高3倍,母离子的碎裂效率提高1.2倍。

(4)

Et=(P+∑Fi)/P0

(5)

利用SIMION仿真软件绘制了占空比为53.125 0%时的稳定性图,示于图5。红色线和蓝色线包围区域的占空比分别为53.125 0%、50%。同时,使用绿色背景表示离子阱中离子同时在x和y方向稳定的区域;灰色背景表示离子阱中离子同时在x和y方向都不稳定的区域;黄色和蓝色分别表示离子在离子阱中径向和轴向的稳定区。可以发现,占空比调整后,稳定性图在q=0的交点(0,0.732)转移到了(0,0.825),当离子发生DDC-CID时,离子在阱中的q值增大更容易发生碎裂。

图5 占空比调整前后数字离子阱稳定性图的变化Fig.5 Changes of digital ion trap stability diagram before and after duty cycle adjustment

3 结论

ITMS中CID的有效性受到低质量截止值和弱碎片产率的限制。随着DDC-CID技术的发展,其可以有效改进碎片离子的检测。因为数字离子阱质谱很容易在驱动射频的周期内调制占空比,从而引入直流,所以在DDC-CID领域有着广阔的应用前景。使用数字离子阱DDC-CID技术可以提高前体离子的裂解效率,经计算,对利血平分子低质量碎片离子的捕获效率可以提高3倍,母离子的碎裂效率可以提高1.2倍。数字离子阱DDC-CID的检测结果与一些商业仪器接近,但商业仪器需要复杂的电路或仪器结构。未来,有待进一步研究在数字离子阱质谱平台上实现DDC-CID激活和弹出,同时利用仿真软件完全模拟在微型质谱仪上进行的实验。此外,为了计算最佳扫描速度,还需进行进一步的理论计算,推导出相关公式,总结DDC-CID过程中碎裂效率和捕获效率与扫描速度之间的关系。