呼吸机相关性肺炎病原菌释放VOCs的非靶向质谱分析

丁厚文,许 伟,王中新,刘 周,丁月婷,邹 雪,王 琴,张 浩,陈治东,沈成银,周 强

(1.安徽医科大学第二附属医院检验科,安徽 合肥 230601;2.中国科学院合肥物质科学研究院健康与医学技术研究所,医学物理与技术安徽省重点实验室,安徽 合肥230031;3.安徽医科大学第一附属医院检验科,安徽 合肥 230022)

呼吸机相关性肺炎(VAP)是重症监护病房(ICU)内一种高发病率(约5%～40%)和高死亡率(约10%)的医院获得性感染[1-2],由铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等微生物感染引起[3-4]。目前,临床上VAP的诊断依赖于对下呼吸道痰标本的微生物病原学诊断,但痰标本采样操作有创且繁琐,且整个诊断过程耗时24 h以上。

呼气检测具有无创、便捷的特点。近年来,利用呼气中的挥发性有机物(VOCs)筛查与诊断相关疾病得到关注,已涉及胃肠道疾病[5]、肝脏疾病[6]、呼吸系统疾病[7]、糖尿病[8]和癌症[9]等。利用呼气中的VOCs诊断VAP具有一定潜力,已有数项研究尝试得到VAP患者呼气中的特异性VOCs[10-14],然而,由于样本数量小、个体差异大和病原菌不同等原因,获得的结论均不同。但这些研究均认为VAP患者下呼吸道及肺部寄生的病原菌会释放VOCs,这些VOCs会影响受试者呼气中VOCs的具体分布,从而形成具有区分人群效果的标志性VOCs。因此,非靶向检测与分析VAP病原菌释放的VOCs,对相关呼气检测研究具有指导意义。

目前,检测与分析VAP病原菌体外培养过程中释放VOCs的报道不多。Oluwasola等[15]利用热脱附-气相色谱-质谱(TD-GC-MS)法检测阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌共培养过程中释放的VOCs,发现23种含量显著提升且来自于细菌的物质。Filipiak等[16]利用气相色谱-质谱(GC-MS)法对比检测了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌培养过程中的顶空样本,分别释放32、37种VOCs,且特异性VOCs质谱图有明显差异。但引起VAP的病原菌菌种远不止这3种[3-4],因此,有必要系统地研究VAP主要病原菌是否释放特定种类VOCs。

本研究拟在体外培养铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和表皮葡萄球菌等8种VAP病原菌,获取其培养过程中的顶空样本,利用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)法进行检测,分析并讨论8种VAP病原菌所释放VOCs的异同。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

气相色谱-三重四极杆质谱仪:美国Thermo Fisher公司产品,配有电子轰击离子源(EI)及Xcalibur 2.2数据处理系统;紫外分光光度计:上海美普达仪器有限公司产品,配有长寿命氘灯、钨灯;摇床培养箱:上海力辰仪器科技有限公司产品,配有回旋、往复振荡系统。

1.2 菌株与材料

临床上常见的VAP病原菌有近20种[17]。美国胸科学会的统计报告[18]显示,VAP事件中各类病原菌占比为:铜绿假单胞菌24.4%,金黄色葡萄球菌20.4%,肠杆菌科14.1%,不动杆菌属7.9%,嗜麦芽窄食单胞菌1.7%,凝固酶阴性葡萄球菌1.4%,嗜血杆菌属9.8%,链球菌属8.0%,肺炎链球菌4.1%,奈瑟菌属2.6%,厌氧菌0.9%,真菌0.9%,其他3.8%。因此,本研究遴选了8种常见且具有代表性的标准菌株作为研究对象,包括铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、大肠埃希菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、嗜麦芽窄食单胞菌(ATCC17666)和表皮葡萄球菌(ATCC12228),所有标准菌株均购自上海鲁微科技有限公司。

正己烷中C10～C40正构烷烃类混标(1 000 mg/L):北京坛墨质检科技有限公司产品;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基:青岛海博生物技术有限公司产品;封口膜:美国Bemis公司产品;高纯空气、高纯氦气:纯度>99.999%,南京特种气体有限公司产品;PVF采样袋:大连德霖气体包装有限公司产品;125 mL顶空瓶:自制。

1.3 体外培养与顶空采样

1.3.1体外培养标准菌株 将保存完好的标准菌株在37 ℃以200 r/min摇动孵育过夜,随后将少量菌液置于试管中,用紫外分光光度计检测均质菌液在600 nm波长处的吸光值(OD600),兑入0.9%氯化钠溶液稀释菌液,直至被稀释至OD600=1。TSB培养基为加富培养基,广泛用于培养好氧菌、厌氧菌和真菌,取25 mL配制的TSB培养基和1 mL稀释后的菌液,先后加入顶空瓶中,使用封口膜将顶空瓶的进气与出气导管口密封,于37 ℃摇床培养箱中培养,充分振荡。

1.3.2顶空采样 体外培养过程中,细菌在顶空瓶的瓶体中增殖,培养基上方100 mL的空体积中积聚了大量细菌产生的VOCs,振荡培养10 h后进行顶空采样。使用玻璃注射器向该器皿的进气导管匀速注入100 mL载气(高纯空气),经导管引导后从底部注入培养基,随后将筒体中的顶空气体从出气导管压出,使用200 mL PVF采样袋收集顶空气体。实验流程示于图1。

图1 病原菌的体外培养及顶空获取(a)、利用PVF采样袋和SPME-GC-MS收集和检测顶空样本(b)的示意图Fig.1 Schematic diagrams of in vitro cultivation and headspace acquisition of pathogenic bacteria (a), collection and detection of headspace samples using PVF sampling bags and SPME-GC-MS (b)

1.4 顶空检测与保留指数计算

1.4.1样品预处理 首先将SPME纤维在200 ℃气相色谱进样口预处理30 min,去除可能残留的VOCs。随后进行预富集,在37 ℃恒温箱中对PVF采样袋进行VOCs顶空固相微萃取,将萃取纤维(65 μm厚PDMS/DVB)刺入袋内,萃取40 min。最后,将萃取的VOCs通过气相色谱-三重四极杆质谱仪检测。

1.4.2色谱条件 TG-624SILMS色谱柱(30 m×0.32 mm×1.80 μm);载气(高纯氦气)流速1.5 mL/min,不分流进样;进样口温度200 ℃;SPME纤维解吸时间30 s;升温程序:40 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至180 ℃,并保持2 min。

1.4.3质谱条件 EI源;电子能量70 eV,传输线温度275 ℃,质量扫描范围m/z45～300。

1.4.4保留指数(RI) 在非靶向检测中,通过加入正构烷烃的标准混合物以获得保留时间,计算出保留指数。以C10～C40正构烷烃混合标准品的保留时间计算样品中化学成分的RI:

(1)

式中,TR表示保留时间,x表示待分析的化合物,n表示正构烷烃的碳原子数,且TR(n)

取20 μL正己烷中C10～C40正构烷烃类混标溶剂于10 mL顶空瓶中,以相同的色谱和质谱条件进行顶空检测,得到各正构烷烃的保留时间。根据组分和各正构烷烃的保留时间计算样品中组分的RI值。RI文献值参考PubChem数据库中的检索结果。

2 结果与讨论

借助NIST质谱数据库对VOCs进行定性分析,当计算得到的反向检索指数(RSI)超过800时认为匹配良好。通过顶空气体可以检测到VAP病原菌体外培养过程中释放的VOCs,但培养基本身也会释放一定种类及浓度的VOCs,为避免此干扰,本实验以空白培养基为背景进行判定。判定准则为:若质谱检测到某种细菌产生的某种VOC的峰面积大于或等于2倍背景值,则认为此细菌释放了该VOC,否则认为该VOC来自培养基。培养基的VOC释放情况与空气背景进行对比判定。随后,将SPME-GC-MS检测到的VOCs按照酮、醛、醚、醇、酸、酯、烷烃、苯系物、酰胺和(含氮)杂环进行分类讨论。

2.1 酮、醛类VOCs

8种病原菌产生的酮、醛类VOCs的检测结果列于表1。8种病原菌中仅金黄色葡萄球菌释放了2-丁酮和3-羟基-2-丁酮,其余菌种均不产生酮类VOCs。Zechman等[19]与Filipiak等[16]利用GC-MS检测到金黄色葡萄球菌会释放2-丁酮与3-羟基-2-丁酮,与本研究结果一致。在由金黄色葡萄球菌致病引起的囊肿性纤维化(CF)患者的呼气检测中[20-21]发现,患者呼气中的2-丁酮上升,表明其可能部分来源于寄生细菌代谢。此外,取由金黄色葡萄球菌导致的细菌性鼻窦炎(BS)患者的鼻窦粘液进行测试,观察到3-羟基-2-丁酮的异常释放[22],表明金黄色葡萄球菌在人体内(BS患者鼻窦处)会产生3-羟基-2-丁酮,这与体外培养的模拟结果相符。

肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌和阴沟肠杆菌会释放一定种类及浓度的醛类VOCs,包括异戊醛和五氟苯甲醛,但在空白培养基中不存在。根据报道[16,23],乙醛是一种普遍的细菌代谢VOC,是生物体中最常见的乙醇氧化产物,而且绝大多数细菌都具有乙醛脱氢酶(ALDH)编码基因[24],即通过ALDH活性进行乙醛代谢的途径在细菌中很常见。乙醛的分子质量为44,与空气中广泛存在的CO2一致,因此,本研究中设置的质量扫描范围起点为m/z45则无法检测到乙醛。在本课题组前期研究[2]中,使用质子转移反应质谱(PTR-MS)检测了5种病原菌体外培养过程中乙醛的浓度变化情况,发现均释放了乙醛。

2.2 醚、醇类VOCs

8种病原菌产生的醚、醇类VOCs的检测结果列于表2。8种病原菌在体外培养过程中均产生了二甲醚,部分产生了二丁醚。肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌释放了二甲基二硫醚(DMDS),大肠埃希菌和嗜麦芽窄食单胞菌释放了二甲基三硫醚(DMTS),均为挥发性含硫化合物(VSCs)。有研究发现,铜绿假单胞菌会释放低浓度的DMDS和DMTS[16],其中DMTS在病原菌培养24 h后开始逐步释放。本研究仅检测到DMDS信号,可能由于培养时间不足,导致DMTS的释放浓度较低,Thorn等[25]的研究也佐证了该观点。Kelly等[26]利用表面增强拉曼光谱(SERS)发现大肠埃希菌产生了DMDS;Ratiu等[27]利用SPME-GC-MS在3种不同培养基质(TSB、MH和M9)中均检测到大肠埃希菌释放了DMDS和DMTS,与本研究结果一致。

在体外培养过程中,病原菌会释放多种醇类VOCs,包括2-乙基己醇、2-甲基-1-丁醇、甲硫醇、2,2-二甲基丁醇、叔丁醇、1-十一醇、2-氯乙醇和2-甲基-3-庚醇。所有病原菌均释放了甲硫醇,其为1种具有恶臭气味的VSC。Allardyce等[28]和Chippendale等[29]在大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长环境中检测到额外的甲硫醇;Tangerman[30]认为哺乳动物体内(特别是肠道)普遍存在由细菌释放的甲硫醇,表明较多细菌具备产生甲硫醇的能力。此外,人体口腔中亦含有低浓度的甲硫醇[31],是由口腔细菌对含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸)降解产生的[32-33]。

2.3 酸、酯类VOCs

8种病原菌产生的酸、酯类VOCs的检测结果列于表3。在所有病原菌中,仅检测到大肠埃希菌产生了乙酸。有研究[28]使用选择离子流动管质谱(SIFT-MS)检测血培养环境下铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌的VOCs释放情况,发现仅有大肠埃希菌生成了乙酸;Sovova等[34]利用SIFT-MS检测深红沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌和大肠埃希菌的VOCs释放情况,同样发现仅有大肠埃希菌产生了乙酸,与本研究结果一致。大肠埃希菌在特定情况下发生三羧酸(TCA)循环的能力是有限的,这可能是其生成乙酸的原因[35]。在高增长率(本研究为大肠埃希菌在TSB培养基中的指数增长)下,由于过程中产生了大量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP),大肠埃希菌合成乙酸作为能量来源路径。

8种病原菌释放了种类繁杂的酯类物质,包括丙烯酸正丁酯、硫代丙酸S-乙酯、乙酸己酯、丙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯和异戊酸乙酯。有报道[16,36-37]指出,不同种类细菌在不同培养基质下同样产生了种类繁杂的酯类物质,如甲基丙烯酸甲酯、乙酸丙酯、苯甲酸甲酯等。Filipiak等[16]认为酯类VOCs的背景浓度相对较高且不稳定,对病原体感染相关的呼气研究而言参考价值较低。

2.4 烷烃、苯系物类VOCs

8种病原菌产生了多种烷烃类VOCs,但苯系物相对较少,列于表4。目前,多项研究表明,一些细菌释放的VOCs包含烷烃类物质,有研究[38]在卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌和嗜肺军团菌的体外培养过程中检测到庚烷和甲基环己烷等烷烃,枯草芽孢杆菌会产生庚烷[39]。此外,铜绿假单胞菌会持续释放正十二烷[40]和亚乙基环丙烷[41]。Patel等[42]利用TD-GC-MS检测到分离培养较困难的艰难梭菌会释放正十二烷,而本课题组亦发现多种病原菌会产生正壬烷、正癸烷、正十一烷、正十四烷、正十五烷等长链烷烃,也有研究报道过细菌释放正十一烷[20]和正十四烷[43]等烷烃类物质。Gao等[43]发现鲍曼不动杆菌在体外培养过程中释放正十四烷,在鲍曼不动杆菌引起的VAP患者呼气中检测到正十四烷升高,与本研究结果一致。

2.5 酰胺、杂环类VOCs

本研究在病原菌顶空中检测到酰胺类(3,5-二羟基苯甲酰胺和N-甲基甲酰胺)和(含氮)杂环类(2,5-二甲基吡嗪和吡嗪)VOCs,列于表5。Mariia等[44]发现,以厚壁芽孢杆菌为代表的菌群含有将Nτ-甲基组氨酸降解为L-谷氨酸和N-甲基甲酰胺的酶,并描述了菌源性N-甲基甲酰胺的生化合成过程,本研究同样在大肠埃希菌、嗜麦芽窄食单胞菌和金黄色葡萄球菌的顶空中检测到了N-甲基甲酰胺。此外,有研究[45-46]报道了N-酰基酰胺类、N-异戊基甲酰胺和N-异戊基乙酰胺等来自于细菌的酰胺类VOCs。吡嗪等含氮杂环类物质在细菌VOCs的研究中鲜有报道,本研究仅在大肠埃希菌中检测到2种相关VOCs,Bean等[47]检测到甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等,与本研究结果部分一致。此外,Dickschat等[48]在体外培养海洋细菌时发现其可以产生多种吡嗪类VOCs,进一步表明部分细菌具有合成含氮杂环类(特别是吡嗪类)物质的能力。

3 结论

本研究在体外培养了铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和表皮葡萄球菌等8种VAP病原菌,并获取顶空样本。利用SPME-GC-MS非靶向检测与分析病原菌释放的VOCs,并进行分类讨论。研究表明,8种VAP病原菌共释放了44种差异性VOCs,包括酮、醛、醚、醇、酸、酯、烷烃、苯系物、酰胺和(含氮)杂环,且均产生了二甲醚和甲硫醇;仅金黄色葡萄球菌释放了2-丁酮和3-羟基-2-丁酮;仅大肠埃希菌产生了乙酸;仅大肠埃希菌、嗜麦芽窄食单胞菌和金黄色葡萄球菌生成了N-甲基甲酰胺。此外,肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌释放了DMDS,嗜麦芽窄食单胞菌释放了DMTS。本研究较系统、具体地分析了8种VAP病原菌释放VOCs的异同,可以为VAP相关的呼气检测研究提供参考。