薄层纸喷雾离子化-小型便携式质谱法即时检验血液中免疫抑制剂

谢以清,郭项雨,张文鹏,欧阳证,马 强

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.北京中医药大学中药学院,北京 102488;3.清华大学精密仪器系,北京 100084)

即时检验(point-of-care testing, POCT)也称床旁检测,是指在采样现场进行的,利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式[1-2]。该技术可以提高工作效率、改善工作流程、节省资源成本、提升工作质量[3-5],现已广泛应用于临床检验、健康管理、体育赛事、娱乐盛会、现场执法、灾难救援等众多领域[6-7]。

随着器官移植技术的成熟,免疫抑制剂的临床使用越来越普及,其临床检测对于用药指导具有重要意义。常见的免疫抑制剂包括环孢素、他克莫司、依维莫司、雷帕霉素和霉酚酸等[8-10],其中,他克莫司因药效强于环孢素而成为临床上普遍采用的免疫抑制药物。但在使用过程中发现,他克莫司存在不良反应大、个体差异大、治疗窗口窄等问题,患者服药后需要测量血药浓度来指导个体化给药。因此在药物的药代动力学、生物等效性研究中亟需开发血液中免疫抑制剂药物的床旁快速检测方法,从而改善用药的安全性,降低他克莫司等免疫抑制剂的肝肾毒性、神经毒性和胃肠毒性等[11-13]。

目前,血液中免疫抑制剂的检测方法主要有免疫反应分析法和色谱-质谱联用法。免疫反应分析法的缺点是可靠性与特异性差;而色谱-质谱联用法通常需要复杂的样品前处理和色谱分离过程,存在检测周期长、无法现场快速检测、无法及时给出用药指导等弊端。因此,开发即时快速检测方法尤为重要[14]。质谱技术具有选择性好、灵敏度高和分析速度快等优点,在众多领域发挥着越来越重要的作用[15-16]。相较于传统实验室的大型质谱仪,小型便携式质谱仪具有体积小、质量轻、功耗低、易携带等优点,是实现样品现场快速检测的核心设备[17]。此外,纸喷雾离子化技术具有离子源制备和操作简单、成本低廉等优点,通过与小型便携式质谱仪联用,可在生命科学、环境监测、毒品检测、消费品安全等领域实现样品的现场快速检测[15]。

本研究以铝基硅胶薄层板制备纸喷雾离子源,利用硅胶的吸附作用,在线完成样品的净化除杂过程,通过耦联小型便携式质谱仪,建立血液中他克莫司(TAC)、依维莫司(EVE)、西罗莫司(SIR)、环孢素A(CSA)、霉酚酸(MPA)等5种免疫抑制剂的即时检验方法,以期为免疫抑制剂的临床检测和用药指导提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Mini β小型便携式质谱分析系统(55 cm×24 cm×31 cm,质量20 kg,功率≤100 W)、SpecMS仪器操控和数据处理软件:北京清谱科技有限公司产品;F254铝基硅胶薄层板:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司产品。

1.2 材料与试剂

他克莫司、依维莫司、西罗莫司、环孢素A、霉酚酸和吲达帕胺标准品:纯度均为98%,德国Dr. Ehrenstorfer公司产品;甲醇(色谱纯):美国Thermo Fisher Scientific公司产品;乙腈、氯仿、二氯甲烷:北京北化精细化学品有限公司产品;兔全血(ACD抗凝剂):生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.3 实验步骤

农田排水沟渠是由植物、土壤/底泥、微生物所组成的半自然生态系统，可以通过植物截留、吸收、生物降解等一系列作用，降低排放到水体中的污染物含量。生态型排水沟渠，既可保持原有的排水功能，又可增强对农田排水所携带的氮磷去除效果。本研究基于多孔透水的沟道护砌材料、垫层材料、沟道植被生态系统、控制排水等方面，在试验示范区构建完整的农田径流生态渗滤沟道系统。

合适的离子化模式对目标物质的分析非常重要。本实验首先在正离子模式下对目标物质进行分析,发现除形成较弱的[M+H]+峰外,还会形成[M+Na]+、[M+K]+峰;而在负离子模式下,各物质形成的[M-H]-峰响应强度明显高于正离子模式下生成的[M+H]+峰。因此,选择在负离子模式下对各物质进行分析。

图1 免疫抑制剂的即时检验流程图Fig.1 POCT workflow of immunosuppressant

1.4 质谱条件

纸喷雾离子化过程中,纸基顶角的角度对离子化效率有着重要影响。本研究考察了5种角度(15°、30°、45°、60°、75°)对质谱信号强度的影响,结果示于图3a。当角度较小时,靶标物质的信号强度较弱;随着角度增加,信号逐渐增强;当角度达到60°时,响应信号强度达到最大;再继续增大顶角角度,信号强度下降,这可能是由于角度过大,目标物质的离子化效率降低所致。因此,选择薄层纸喷雾的顶角为60°。

表1 5种免疫抑制剂及内标物的参数Table 1 Parameters of five immunosuppressants and internal standard

2 结果与讨论

2.1 薄层板的选择

薄层板因涂层不同而具有不同的吸附分离能力,进而影响目标物质的分离效果及质谱响应。血液样品基质复杂,为了提高目标物质的分离效率,提升质谱响应,本研究考察了硅胶薄层板、氧化铝薄层板和纤维素薄层板等3种铝基薄层板。结果表明,当选择铝基硅胶薄层板进行样品洗脱分离时,目标物质的质谱响应最强。这可能是因为铝基硅胶薄层板上的硅胶涂层能够较好地吸附血液中的强极性杂质分子,达到了良好的分离效果,并且该薄层板以金属铝为基材,具有良好的导电性,从而提高了离子化效果。因此,选择铝基硅胶薄层板作为纸喷雾离子源的基底材料。

2.2 离子化条件的优化

从决策阶段、设计阶段、施工阶段及运营阶段的建设工程全寿命周期的角度，构建与工程管理类本科课程体系相匹配的案例库[6]，并开展多种形式的信息化教学活动，如蓝墨云班课、雨课堂、慕课（MOOC）等进行案例教学，同时通过互联网实现大数据记录对教育和学习行为进行高效管理，将教学形式由课上延展到课下，实现学生即时自主学习、师生即时互动，形成以分析解决真实案例为主体的考核方式[7]。

负离子模式,进样时间20 ms,碰撞气为空气,碰撞时间150 ms。5种免疫抑制剂和内标物(吲达帕胺)的喷雾电压、母离子、子离子和碰撞能量列于表1,二级质谱图示于图2。

图3 薄层板顶角角度(a)、洗脱/喷雾溶剂种类(b)、溶剂用量(c)和离子源与进样口距离(d)的优化Fig.3 Optimization of angle of tip (a), elution/spray solvent (b), amount of solvent (c), and distance between tip and inlet (d)

Finite element study on residual stress and strain of strengthened connection

洗脱/喷雾溶剂的选择不仅影响目标化合物从硅胶板表面洗脱的效率,还影响电喷雾电离效果,从而影响目标物质的质谱响应。本研究考察了乙腈、甲醇、氯仿以及二氯甲烷等4种不同极性溶剂对目标物质的检测效果,结果示于图3b。以乙腈作为洗脱/喷雾溶剂时,目标物质的质谱响应信号较弱;以甲醇作为洗脱/喷雾溶剂时,目标物质的响应值最强;以二氯甲烷和氯仿作为洗脱/喷雾溶剂时,目标物质会形成较强的[M+Cl]-峰,但其二级质谱信号较弱,不利于定量分析。因此,选择甲醇作为洗脱/喷雾溶剂。

王丽霞主持筹建了河北省唯一一家食品安全重点实验室、省博士后创新实践基地和省食品安全科普教育基地，使该院成为全省唯一一家同时拥有国家级质检中心、省级科技研发平台及科技人才培养摇篮的单位。她带领全院主持、承担省部级以上科技项目47项，标准制订115项，获省部级科技进步二等奖7项、三等奖10项。出版专著11部，发表学术论文188篇。授权或公开专利14项。作为全院学术带头人，她获河北省科技进步二等奖2项、三等奖2项。主持国家标准制订4项，主持、参与省部级科技项目10项。出版专著6部，发表论文6篇，公开发明专利1项。

将铝基硅胶薄层板剪成边长为1.0 cm的等边三角形,滴加10 μL血液样品,静置30 s,在样品后端滴加20 μL甲醇溶剂。三角形铝基硅胶薄层板底部通过金属夹与小型便携式质谱仪高压源连接,置于质谱仪进样口前端1.0 cm处,施加喷雾电压。在高压驱动下,甲醇向三角形铝基硅胶薄层板前端迁移,完成目标物质的萃取和洗脱过程,并在尖端形成电喷雾,采用小型便携式质谱仪即时检验。血液样品中免疫抑制剂的即时检验流程示于图1。

洗脱/喷雾溶剂的用量是影响分析结果的重要因素。用量过少,会导致洗脱和离子化效率较低,信号减弱;用量过多,液滴之间可能会相互作用,形成较大的液滴,影响离子化效率和信号强度。本研究分别考察了5、10、15、20、25 μL甲醇作为洗脱/喷雾溶剂对质谱响应强度的影响,结果示于图3c。随着甲醇体积增加,目标物质的响应值逐渐增大,当体积为20 μL时,响应信号最强,随后呈下降趋势。因此,选择20 μL洗脱/喷雾溶剂。

离子源是质谱的重要组成部分,离子源与进样口之间的距离对离子化效果和信号强度有着重要影响。距离太近,样品液滴去溶剂化效率低,影响检测信号强度,同时容易击穿空气,产生放电现象;距离太远,雾滴运动受阻,进入离子传输管以及质量分析器的待测离子减少,同样会造成质谱信号响应强度较弱。本实验考察了离子源与进样口之间距离为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm时的信号强度,结果示于图3d。当距离为0.5 cm时,信号强度较低;当距离大于1.0 cm时,随着距离的增加,信号强度逐渐下降。因此,设定离子源与进样口的距离为1.0 cm。

2.3 方法学考察

采用小型便携式质谱检测分析一系列不同浓度的5种免疫抑制剂进行方法学考察,结果列于表2。以3倍和10倍信噪比作为方法的检出限和定量限,分别为0.5～5 mg/L和1～10 mg/L。以5种免疫抑制剂的浓度为横坐标(x),免疫抑制剂与内标物吲达帕胺的峰面积比值为纵坐标(y),绘制标准曲线,其在各自的线性范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r)大于0.99。以经测定不含5种免疫抑制剂的血液样品作为空白基质,分别制备低、中、高3个添加浓度水平的免疫抑制剂基质加标样品进行加标回收实验,每个水平平行测定6次,他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢素A、霉酚酸的回收率分别为96.9%～114.3%、99.7%～111.7%、100.7%～110.0%、94.8%～109.6%、91.0%～110.3%,相对标准偏差分别小于7.1%、4.7%、8.2%、8.6%、8.4%。在此基础上进一步考察方法的稳定性,将加标样品分别置于4 ℃冰箱和室温下,12 h后测定,每个水平平行测定6次。在不同的测定时间、各水平的测定浓度值与真实值较接近,相对标准偏差小于8.1%,表明不同温度下的样品测定稳定性良好。由此可见,该方法准确稳定,可用于血液中免疫抑制剂的即时检验。

用于向山体灌注硫酸铵溶液等药物来分离稀土矿，通常建于地势较高的山顶，形状上有方形、圆形，色调上因为有水呈现灰黑色调，可见进水水管，周围山体可见铺设的水管。灌水池典型影像，见图4(b)。

表2 方法的检出限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数和加标回收率Table 2 Results of LOD, LOQ, linear range, linear equation, correlation coefficient and recovery

2.4 样品检测

以兔全血模拟实际血样,制备得到含100 mg/L他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢素A和霉酚酸的样品,采用薄层纸喷雾离子化-小型便携式质谱法进行即时检测,测得其浓度分别为 98.9、101.3、100.9、98.1、99.2 mg/L。同时,采用液相色谱-串联质谱法[18]进行分析,测得他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢素A、霉酚酸的浓度分别为98.7、99.3、101.5、100.6、98.4 mg/L。本方法的检测结果与传统方法接近。

总体而言,本方法的检出限略高于传统的大型色谱-质谱联用法,一方面是由于小型便携式质谱仪以线性离子阱作为质量分析器,而传统的大型质谱仪通常以三重四极杆作为质量分析器;另一方面,本研究采用薄层纸喷雾作为原位电离源,省去了传统的色谱分离过程,而在一定程度上损失了灵敏度。但本方法可以提高检测速度、缩短检测周期,更适合临床用药监测及快检的需求。本方法与传统方法的检测周期对比情况列于表3。

表3 本方法与文献报道方法的比较Table 3 Comparison of the current method and other literature approaches for the analysis of immunosuppressants in blood samples

3 结论

本研究以铝基硅胶薄层板为基材制备纸喷雾离子源,结合小型便携式质谱,建立了血液中他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢素A和霉酚酸等5种免疫抑制剂的即时检验方法。该方法简便快速、准确可靠,可在1 min内完成样品的检测分析,为免疫抑制剂的临床快速检测提供了解决方案,具有良好的应用前景。