NLRP3炎性小体活化与细胞焦亡在肝纤维化中的作用

李珂云，陈水亲，张 婷，黄瑜涵，肖子庆，黄彬红，张文娟

（1. 赣南医学院基础医学院；2. 赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室；3. 赣南医学院第一临床医学院，江西 赣州 341000）

肝纤维化是一种肝内结缔组织异常增生的病理性过程，通常由病毒、酒精和药物等多种因素引起，是一种对肝脏受到持续性损伤后发生的一系列针对炎性刺激的慢性修复反应［1］。肝纤维化的特征是细胞外基质的过度积累，形成纤维瘢痕并取代原有肝细胞，导致肝组织损伤和功能障碍。该过程涉及肝实质细胞、肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）、肝巨噬细胞（Kupffer cells，KC）。全球患有肝纤维化的人数不断增加。据统计，全球肝纤维化患者人数由2017 年的7.4 亿人增加至2022 年的8.21 亿人［2］。如果治疗不及时，肝纤维化会持续进展为肝硬化［3］。我国作为肝病大国，目前约有700万肝硬化患者。而肝纤维化作为早期肝损伤进展至肝硬化的过渡阶段，是一种可逆的肝损伤，因此，该阶段是阻止早期肝损伤发展为肝硬化的关键阶段［4］。尽管肝纤维化的发病机制仍不清楚，但已有证据表明先天免疫反应在肝纤维化的发生发展中具有重要作用。

先天性免疫反应作为机体的第一道防线，通过抵御病原微生物感染，以维持机体内环境的稳定［5］。当机体受到各种刺激时，免疫细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）识别细胞外的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者细胞内的损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）触发先天免疫反应［6］。PRRs 分为胞膜型、内体型、胞浆型和分泌型，而NLRP3 炎性小体属于胞浆型PRRs［7］。NLRP3 炎性小体作为一种多蛋白复合物，表达于肝脏实质细胞和非实质细胞中。其多蛋白复合物包括NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosisassociated specklike protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬蛋白酶1 前体（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase1，pro-Caspase-1）。NLRP3 活化后，通过接头蛋白ASC，募集pro-Caspase-1，形成NLRP3-ASC-pro-Caspase-1复合物，即NLRP3炎性小体［8］。NLRP3 炎性小体一旦形成，pro-Caspase-1 前体便发生自活化，形成Caspase-1［9］。Caspase-1 一方面可促使促炎细胞因子前体（比如：pro-IL-1β、pro-IL-18）成熟，形成成熟的白介素-1β（Interleukin，IL-1β）和白介素18（Interleukin-18，IL-18），另一方面可以剪切gasdermin D（GSDMD）的N 段片段，形成Gasdermin D-NT，Gasdermin 逐渐聚集在细胞膜上形成孔道［10］。IL-1β和IL-18通过孔道，释放至细胞外，同时细胞发生焦亡［11］。

传统观点认为细胞焦亡是细胞代谢停止、结构破坏和功能丧失的过程。这一过程对机体造成不可逆性的损害。然而，现在观点认为细胞焦亡是机体正常的生理过程，且有利于机体稳态的维持。比如：细胞焦亡有利于清除破坏的、有害的和冗余的细胞［12］。依据细胞死亡过程是否需要调控，将细胞死亡分为偶然性细胞死亡（Accidental cell death，ACD）和调节性细胞死亡（Regulatory cell death，RCD）［13］。ACD 是由物理、化学或者药物等因素引起的不可避免的细胞死亡过程。RCD 是由多种分子参与调控的细胞死亡过程［14-15］。肝细胞的死亡伴随有NLRP3 的活化和NLRP3 炎性小体的形成。NLRP3 炎性小体的不断活化，促使肝脏不断的愈合修复，形成肝脏纤维化。本文总结了NLRP3 炎性小体的结构和活化机制，并阐述NLRP3 炎性小体和细胞焦亡在肝纤维化中的作用。

1 NLRP3炎性小体的结构

NLRP3 炎性小体由3 部分组成，即NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1［16］。NLRP3 主要由3 种结构域组成，羧基端（C 端）是富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeats，LRR）、中心端是核苷酸结合寡聚化结构域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD，又名NACHT）、氨基端（N 端）是热蛋白结构域（Pyrin domain，PYD）。NLRP3 先通过LRR识别信号，再通过NACHT 的ATP 酶介导自身寡聚化，并经由PYD 的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）募集pro-Caspase-1形成NLRP3炎性小体。

2 NLRP3炎性小体的活化机制

NLRP3 可以被PAMPs 和DAMPs 活化。其中，PAMPs 涉及病原微生物（比如：金黄色葡萄球菌、肠道杆菌、寄生虫等）、晶体成分（比如：草酸钙、硅、石棉等）等。DAMPs 涉及代谢产物（比如：血糖、血脂等）、氧化型产物（比如：线粒体DNA 等）等［17-18］。目前NLRP3 炎性小体活化的途径有3 条：“经典”NLRP3 炎性小体活化途径、“非经典”NLRP3 炎性小体活化途径［19］、“替代”NLRP3 炎性小体活化途径［20］。

2.1 “经典”NLRP3炎性小体活化途径大多数观点认为NLRP3 炎性小体的活化分为“准备阶段”和“活化阶段”。病原微生物及其产物通过相应受体（比如：Toll 样受体、细胞因子受体）活化核转录因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），促使NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18 转录并翻译。转录翻译后，通过磷酸化、泛素化途径，修饰上述蛋白分子［21］。这一过程为NLRP3 炎性小体活化提供物质基础，即为“准备阶段”［8］。“活化阶段”主要是NLRP3 被NLRP3 激动剂识别后，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1 一起组装成NLRP3 炎性小体，且发生活化。据报道，NLRP3 的活化过程受多种因素影响，比如：K+外流、Na+内流、Cl-外流、Ca2+动员、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）等［22-26］。尽管这些因素都可以活化NLRP3炎性小体，但是NLRP3炎性小体尚没有统一的活化机制。因此，NLRP3 炎性小体的活化途径仍有待进一步研究。

2.2 “非经典”NLRP3 炎性小体活化途径与“经典”途径相比，NLRP3 炎性小体活化的“非经典”途径主要激活Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5 等［27］。并且NLRP3 炎性小体的“非经典”活化途径并不是必须需要“准备阶段”。小鼠细胞中Toll 样受体（Toll-like Receptor Signaling，TLRs）/细胞因子受体刺激剂，先通过活化NF-κB，诱导Ⅰ型干扰素（type I interferon，I-IFN）产生，再通过JAK/STAT 信号通路/补体C3-C3R 轴，促使Caspase-11 的表达，这个过程需要“准备阶段”。而人体细胞中Caspase-4 和Caspase-5的表达并不需要NLRP3炎性小体的“准备阶段”［28］。活化后的Caspase-11，可以剪切GSDMD的Asp276 位点。活化后的Caspase-4、Caspase-5 可以剪切GSDMD 的Asp275 位点。GSDMD 被剪切后，可以释放N 端的结构域，成为GSDMD-NT。GSDMD-NT 可以与细胞膜上的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸盐、磷脂酰丝氨酸结合，在细胞膜上形成孔道，同时细胞也发生焦亡。这一过程可以激活K+外流依赖的NLRP3炎性小体“经典”活化途径［29-30］。目前已经发现脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的氧化磷脂可以直接与小鼠细胞中的Caspase-11 结合，或直接与人体细胞中的Caspase-4、Caspase-5 结合，活化树突状细胞（Dendritic cells，DCs）中的NLRP3 炎性小体为“非经典”活化途径，但具体机制尚不完全清楚［31］。

2.3 “替代”NLRP3炎性小体活化途径与NLRP3“经典”和“非经典”活化途径相比，发现仅用TLRs激动剂处理也可以诱导人/猪单核细胞中的Caspase-1活化，而Caspase-1 依然可以诱导IL-1β 的成熟和分泌［32］。研究发现“替代”NLRP3 炎性小体活化途径是LPS通过TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CAPS8信号通路直接活化NLRP3。与NLRP3 炎性小体“经典”活化途径相比，NLRP3 炎性小体“替代”活化途径也有NLRP3-ASC-pro-Caspase-1 复合物的形成，但是没有“典型”的ASC 斑点形成、K+外流和细胞焦亡［33-34］。载脂蛋白C3可以使TLR2/TLR4形成异源二聚体，通过TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2 轴，导致Ca2+内流、ROS 产生，活化NAPDH 氧化酶，最终活化Caspase-8［33］。Caspase-8是NLRP3炎性小体“替代”活化途径的上游，但其确切机制有待进一步阐明。

3 NLRP3炎性小体活化在肝纤维化中的作用

肝纤维化是肝脏针对有害刺激的愈合修复反应。肝纤维化形成后，正常的肝细胞被破坏，出现大量的HSCs［1］。HSCs不断增多，形成细胞外基质覆盖于肝脏［35］。肝纤维化形成过程中涉及多种细胞参与，如：肝实质细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞［1］。这些细胞都表达NOD 样受体（NOD-like receptors，NLRs），其中NLRP3 是NOD 样受体中最常见的受体。肝纤维化发生时，肝实质细胞、Kupffer 细胞和肝星状细胞中都有NLRP3炎性小体的活化［36］。

3.1 肝实质细胞与NLRP3 炎性小体活化肝脏中的主要细胞是肝实质细胞，占据肝脏细胞总数的60%～80%。细菌、病毒、真菌作用于肝实质细胞后，依赖于ROS、mtDNA、P2X7 途径，促使肝实质细胞合成pro-Caspase-1、pro-IL-1β 以及pro-IL-18［36］。NLRP3 炎性小体经“经典”活化途径，启动炎性反应，最终肝实质细胞发生焦亡［11］。肝实质细胞的焦亡，依次活化Kupffer细胞、肝星状细胞，导致肝纤维化的发生［37］。

3.2 Kupffer 细胞与NLRP3 炎性小体活化Kupffer 细胞是位于肝窦内的巨噬细胞，占肝脏非实质细胞的10%～15%，全身巨噬细胞的80%～90%，通过分泌细胞因子发挥功能［1］。Kupffer 细胞活化后，可根据分泌细胞因子的不同，分为M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞［38］。M1 型巨噬细胞依赖NLRP3 炎性小体“经典”活化途径，分泌促炎细胞因子白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor -α，TNF-α），引起炎症反应［39］。M2 型巨噬细胞在PAMPs 刺激下，分泌抗炎细胞因子转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白介素10（IL-10），通过活化肝星状细胞，修复损伤组织［39］。Kupffer 细胞中具有多种模式识别受体，比如：Toll 样受体、清道夫受体、NOD 样受体。这些受体识别PAMPs、DAMPs后，依赖NLRP3“经典”活化途径，活化NLRP3 炎性小体［39］。在氧化应激反应中，Kupffer 细胞依赖于ROS-TLR9 途径，活化NLRP3 炎性小体［39］。研究表明Toll 的配体可以增强NLRP3 炎性小体的活化，比如LPS 识别TLR4 途径，活化NLRP3 炎性小体［39］。TLR9 激动剂ODN1668 通过TLR9，也活化NLRP3 炎性小体［39］。Kupffer细胞中NLRP3炎性小体活化后，通过活化HSCs，参与肝纤维化过程［40］。

3.3 肝星状细胞与NLRP3 炎性小体活化肝星状细胞作为肝脏的非实质细胞，位于肝脏的窦间隙，占肝脏细胞总数的8%～13%［41］。HSCs 是肝纤维化发生发展的关键细胞［42］。HSCs 活化包括“启动”和“持续”阶段。“启动阶段”是HSCs 由静止状态转变为活化状态，“持续阶段”是肝纤维化形成阶段［43］。肝脏受到刺激后，一方面肝实质细胞和Kupffer 细胞释放的IL-1β 和IL-18，通过HSCs 表面的白介素1β 受体（Interleukin-1β receptors，IL-1βR）和白介素18 受体（Interleukin-18 receptors，IL-18R）进入HSCs；另一方面肝实质细胞中的NLRP3 炎性小体可通过胞吞的方式进入HSCs［44］。HSCs 受到刺激后，转变为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞可分泌α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ，形成细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），导致肝纤维化［45-46］。研究［47］表明，在血吸虫感染当天给予MCC950，可以抑制NLRP3 炎性小体活化，引起肝实质细胞和Kupffer 细胞IL-1β和IL-18 释放减少，同时HSCs 胞吞NLRP3 炎性小体减少，使得HSCs 的“启动”和“活化”减弱，从而减轻肝纤维化。

4 细胞焦亡在肝纤维化中的作用

细胞焦亡依赖Caspase-1-Gasdermin D 路径形成细胞膜孔道。孔道形成后，细胞内容物被释放，水分进入细胞内，造成细胞肿胀，最终细胞发生焦亡［48］。细胞焦亡可“间接”或者“直接”参与肝纤维化的发生。细胞焦亡的“间接”途径为焦亡细胞诱导肝细胞死亡。肝细胞死亡，可募集并活化单核细胞。单核细胞受到刺激后，可向M2 型Kupffer 细胞趋化［49］。M2 型Kupffer 细胞通过分泌TGF-β，活化HSCs。活化的HSCs 是肝纤维化形成的核心细胞。细胞焦亡的“直接”途径为焦亡细胞释放的内容物直接活化HSCs，促进肝纤维化的发生发展。

4.1 肝实质细胞焦亡肝实质细胞损伤是肝纤维化发生发展的始发因素。肝实质细胞受到损伤后，依赖NLRP3 炎性小体“经典”活化途径，在细胞膜表面形成Gasdermin D-NT，最终肝实质细胞发生焦亡。肝实质细胞的焦亡可以触发Kupffer细胞、肝星状细胞中NLRP3 炎性小体活化，最终活化HSCs 形成肝纤维化。Caspase-1 抑制剂可以抑制肝实质细胞焦亡，进一步抑制HSCs活化，缓解肝纤维化［50］。

4.2 Kupffer 细胞焦亡Kupffer 细胞作为驻留在肝脏中的吞噬细胞，是肝脏抵御病原微生物的第一道防线，同时也是参与肝纤维化过程的重要细胞。Kupffer 细胞在肝纤维化的发生发展中起到关键作用［51］。Kupffer 细胞焦亡，可促进肝纤维化发生发展，抑制Kupffer细胞焦亡，可减轻小鼠的肝纤维化。给予Kupffer 细胞LPS 后，在Kupffer 细胞中可见NLRP3 炎性小体和细胞膜上孔道形成，并出现Kupffer 细胞焦亡［52］。提前用不饱和脂肪酸——二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）和花生四烯酸 （Arachidonic acid，AA）干预后，再给予LPS，发现LPS 诱导的NLRP3 炎性小体活化减弱，且Kupffer细胞的焦亡情况减轻［53］。不饱和脂肪酸是G蛋白偶联受体120（G-protein-coupled receptor 120，GPR120）的配体。研究发现，DHA 和AA 通过使GPR120从细胞膜向细胞质转移来减轻Kupffer 细胞焦亡［54］。Kupffer 细胞发生焦亡后，释放的炎性细胞因子与HSCs细胞表面的受体结合，最终活化HSCs，导致肝纤维化。

4.3 肝星状细胞焦亡HSCs中存在少量NLRP3炎性小体，当机体受到外界刺激时，细胞内Caspase-1、GSDMD 被激活，并分泌促炎因子，诱导HSCs 焦亡，并且促使HSCs 转化为肌成纤维细胞，进一步诱导肝脏炎症和肝纤维化［48］。促进HSCs 焦亡可减少胶原蛋白-Ⅰ和α-SMA 的含量，以及ECM 的形成和沉积，以减轻肝纤维化［55］。研究表明，酸敏感离子通道1a（Acid sensitive ion channels，ASIC1a）可以抑制酸诱导的肝纤维化中HSC 的焦亡，而Ca2+作为第二信使，由ASICa 运输，参与HSCs 活化［56］。在酸性条件下ASIC1a 通道被打开，促进Ca2+进入细胞，与传统认为的Ca2+内流促进NLRP3炎性小体活化矛盾的是，该研究表明，Ca2+内流减少了NLRP3炎性小体的组装，引起gasdermin D 活性减弱以及IL-18 和IL-1β的释放减少，从而减轻HSCs的焦亡，促进ECM 沉积加剧肝纤维化，而抑制ASIC1a可以促进细胞焦亡减少沉积以缓解肝纤维化［56］。

5 小结与展望

NLRP3 炎性小体是位于细胞质中的多蛋白复合物，由天然免疫蛋白NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 组成。NLRP3 炎性小体表达于肝实质细胞、Kupffer 细胞和肝星状细胞中。当肝脏受到PAMPs/DAMPs刺激时，这些细胞中的NLRP3炎性小体发生活化。NLRP3 炎性小体的活化，可以使肝实质细胞、Kupffer 细胞、HSCs 发生焦亡。NLRP3 炎性小体的活化和细胞焦亡共同参与肝纤维化的发生发展。了解肝纤维化中NLRP3 炎性小体的活化机制和细胞焦亡，有助于开发以NLRP3 炎性小体/细胞焦亡相关分子为中心的药物，为肝纤维化的治疗提供新的治疗靶点。