6-姜烯酚对鼻咽癌的作用及机制研究

李泰运，廖 钰，陈保平，周君怡，张 敏，刘品月

（湖南医药学院基础医学院，湖南 怀化 418000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是指起源于鼻咽腔表面上皮细胞或鼻咽隐窝上皮的恶性肿瘤。据统计该病80%发生在我国，尤其高发于湖南与两广地区，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首［1-2］。目前鼻咽癌治疗手段多为放疗结合化疗的综合治疗，但其毒副作用大，易导致许多不良反应和后遗症［3-5］。现代药理和临床研究表明姜在肿瘤治疗方面具有很好的疗效。6-姜烯酚（6-shogaol）是生姜和干姜中主要成分6-姜酚脱水形成的烷基酚类化合物，对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用［6-8］。本文以人鼻咽癌CNE2 和HNE2 细胞为模型，探究6-姜烯酚是否对CNE2和HNE2细胞的增殖有抑制作用，进一步拓展6-姜烯酚的抗肿瘤作用，为鼻咽癌的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂6-姜烯酚（上海源叶生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco 公司）；DMEM 培养基（Thermo Fisher Scientific 公司）；CCK-8 试剂盒、RIPA 蛋白裂解液、Annexin V-FITC 试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；青-链霉素（Sigma 公司）；BCA 蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad 公司）；PCNA、Caspase-3、Occludin、E-cadherin 和Vimentin 的兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司）；增强型化学发光试剂盒（EMD Millipore公司）；GAPDH兔重组单克隆抗体和HRP-羊抗兔IgG 二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.1.2 细胞人鼻咽癌CNE2 和HNE2 细胞系（上海中国科学院细胞库）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组CNE2和HNE2细胞分别用含有10%FBS、1%青-链霉素的DMEM 和PRMI 1640 培养基在5%CO2，37 ℃培养箱内培养。当细胞汇合度达70%时，进行传代用于后续实验。将CNE2和HNE2细胞分别分为CNE2空白组（CNE2-Blank）、CNE2对照组（CNE2-DMSO）、CNE2-6-姜烯酚处理组（CNE2-6-shogaol）；HNE2 空白组（HNE2-Blank）、HNE2 对照组（HNE2-DMSO）、HNE2-6-姜烯酚处理组（HNE2-6-shogaol）。细胞处理：CNE2 和HNE2 空白组细胞正常培养；CNE2和HNE2对照组细胞加入同体积DMSO；CNE2-6-姜烯酚处理组和HNE2-6-姜烯酚处理组在细胞中加入6-姜烯酚（25 μmol·L-1）。

1.2.2 半抑制浓度（IC50）测定CNE2-6-姜烯酚处理组和HNE2-6-姜烯酚处理组细胞各分为三组分别加入浓度为10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1和50 μmol·L-1的6-姜烯酚溶液，5%CO2，37 ℃饱和湿度的培养箱内孵育48 h，每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，4 h后终止培养，吸出培养液，每孔加入150 μL 的DMSO，置摇床上低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪OD490 nm 处测量各孔的吸光值，分析各浓度水平的剂量值（即IC50）和95%可信区间值。

1.2.3 CCK-8 法CNE2 和HNE2 细胞以浓度3×103个/孔接种于96孔板中。当细胞完全贴壁后定义为0 h，在每孔中分别于0 h、24 h、36 h 和48 h 加入20 μL CCK-8溶液，将孔板继续置于培养箱中孵育2 h。使用Spectra Max M5 多功能微孔酶标仪，450 nm 波长测定吸光度值（OD值）。

1.2.4 细胞划痕实验取对数生长期的CNE2 和HNE2 细胞按2×105个·mL-1密度、每孔500 μL 接种在6孔板中，培养24 h。当细胞融合到90%左右时，用20 μL 的枪头在孔中划“井”字并吸出培养基，用PBS 冲洗2 次，将脱落的细胞洗掉，此时定义为伤口愈合0 h，对照组和6-姜烯酚处理组分别加入含有同体积的DMSO 或25 μmol·L-1的6-姜烯酚培养液，将细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱培养48 h 后，观察不同组CNE2和HNE2细胞迁移状况，拍照并确定划痕边缘区域及相对距离，实验结果通过Image J软件分析细胞的迁移率。细胞迁移率＝（0 h划痕面积-48 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡约1×105个·mL-1的CNE2 和HNE2 细胞接种于24 孔板中，培养24 h后，用DMSO 或终浓度为25 μmol·L-1的6-姜烯酚处理48 h，收集细胞。按照Annexin V-FITC 凋亡试剂盒说明书对细胞进行染色，经流式细胞仪分析各组的细胞凋亡情况。

1.2.6 Western blot 检测相关蛋白表达CNE2 细胞5×105个·mL-1接种于6 孔板中，待细胞生长达到50%汇合度时，用DMSO 或25 μmol·L-1的6-姜烯酚处理48 h 后，收集细胞。细胞经RIPA 蛋白裂解液冰浴裂解30 min，4 ℃离心30 min，收集细胞裂解上清，经BCA 法测定蛋白浓度。取大约20 μg 总蛋白进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后，蛋白质转移至PVDF 膜上。PVDF 膜用5% 脱脂奶粉封闭2 h，室温孵育相应一抗（PCNA、Caspase-3、occludin、E-ccadherin 和vimentin）2 h，随后，室温孵育二抗1 h，免疫化学发光法进行蛋白显影。使用Image J软件测定分析灰度值。

1.3 统计学分析所有数据均来自3 次独立重复实验，并以表示。SPSS 19.0和GraphPad Prism 7进行统计分析。多组定量资料比较用单因素方差分析，两组间多重比较用Dunnett'st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6-姜烯酚半抑制浓度（IC50）测定6-姜烯酚的IC50为26.94 μmol·L-1，95%可信区间（95%CI）为24.22～29.71 μmol·L-1（图1）。后期的实验均用25 μmol·L-16-姜烯酚处理CNE2和HNE2细胞。

图1 6-姜烯酚对CNE2细胞的IC50

2.2 6-姜烯酚对鼻咽癌细胞增殖的影响与空白组比较，对照组OD 值均无明显差异；与对照组比较，CNE2-6-姜烯酚和HNE2-6-姜烯酚处理组24 h、36 h 和48 h 的OD 值均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 CCK-8分析6-姜烯酚对鼻咽癌细胞增殖的影响

2.3 6-姜烯酚对鼻咽癌细胞迁移的影响6-姜烯酚处理CNE2和HNE2细胞后48 h后，CNE2空白组、CNE2 对照组、HNE2 空白组和HNE2 对照组中的划痕面积缩小，但CNE2-6-姜烯酚处理组和HNE2-6-姜烯酚处理组划痕面积仍较大。经统计分析发现，空白组和对照组中细胞迁移率均达90%以上，而6-姜烯酚后细胞迁移率约为75%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 6-姜烯酚对鼻咽癌细胞迁移的影响

2.4 6-姜烯酚对鼻咽癌细胞凋亡的影响CNE2空白组细胞凋亡率为5.01%，CNE2 对照组细胞凋亡率为6.15%，两组间无明显差异；但CNE2-6-姜烯酚处理组细胞凋亡率为9.23%，明显高于对照组。HNE2 空白组细胞凋亡率为3.33%，CNE2 对照组细胞凋亡率为5.73%，两组间无明显差异；但CNE2-6-姜烯酚处理组细胞凋亡率为10.91%，明显高于对照组（图4）。

2.5 6-姜烯酚对鼻咽癌细胞相关蛋白表达的影响与对照组比较，CNE2-6-姜烯酚处理组细胞Caspase-3表达明显增加，PCNA 蛋白表达明显减少，Vimentin蛋白表达明显减少，而Occludin和E-cadherin的表达量显著增加（图5）。

图5 6-姜烯酚对CNE2细胞相关蛋白表达的影响

3 讨论

鼻咽癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤，早期多采用放疗为主的方法治疗。但由于鼻咽腔位置隐蔽和临床症状表现多样，约75%的患者确诊即处于中晚期，必须采用放疗、化疗和分子靶向治疗的综合治疗策略［9］。经综合治疗后，复发或转移性鼻咽癌（R/M NPC）的预后仍非常差，中位总生存期（OS）约为20 个月［10］。中药有效成分抗肿瘤的开发与应用已成为研究热点。生姜是我国常用的药食两用植物，广泛用于治疗感冒、风湿、关节炎、高血压和消化系统等疾病［11-12］。生姜中主要的活性成分是姜酚及姜辣素，遇热后姜酚可通过脱水反应生成6-姜烯酚［13-14］。有研究［15-20】表明，6-姜烯酚具有防治心血管疾病、老年痴呆、胃溃疡，抗肝炎病毒、恢复因脊髓损伤所致的运动功能障碍等多种生物学活性。除此之外，6-姜烯酚对多种不同肿瘤细胞的增殖具有明显的体外抑制作用，并通过抑制侵袭迁移、调节细胞周期诱导凋亡、调控相关信号通路蛋白表达等多种机制发挥抗肿瘤或逆转耐药的效用［21］。在本研究中，我们通过CCK-8 法检测到6-姜烯酚处理组CNE2 和HNE2 细胞增殖率都明显下降，Western blot 也检测到6-姜烯酚处理组PCNA 蛋白表达量明显减少。因此，6-姜烯酚可以有效抑制CNE2 和HNE2细胞的增殖。

细胞凋亡是抗肿瘤药物诱导细胞死亡的最常见方式［22］。因此，调控凋亡相关基因或其产物，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，诱导肿瘤细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键之一。RAY A 等［23］发现6-姜烯酚对乳腺癌细胞可造成不可逆的G2/M期周期阻滞，通过激活细胞的自噬作用、降低蛋白Hes1 和Cyclin D1 的表达等，有效诱导其凋亡，并对非肿瘤细胞无抑制作用。SAHA A 等［24］发现6-姜烯酚通过提高Caspase-7 的表达以及促进PARP 失活等机制诱导人前列腺癌细胞凋亡。PAN M H 等［25］发现6-姜烯酚可活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，调高GADD153 表达诱导人结肠癌细胞凋亡。由此可见，6-姜烯酚能通过调控多条信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现，6-姜烯酚处理后通过流式细胞术检测到CNE2和HNE2细胞凋亡率明显提高，且经Western blot 检测细胞中Caspase-3 蛋白表达也有明显增加。提示6-姜烯酚也可促进鼻咽癌CNE2和HNE2细胞的凋亡。

鼻咽癌细胞极易发生转移和侵袭是鼻咽癌预后不良的重要因素［26］。多项研究［27-30］表明，6-姜烯酚可以显著抑制肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究用6-姜烯酚处理鼻咽癌CNE2和HNE2细胞后，通过细胞划痕实验分析发现6-姜烯酚能明显抑制鼻咽癌CNE2 和HNE2 细胞的迁移，且Western blot结果表明细胞间质相关蛋白Vimentin表达下降，同时细胞上皮相关蛋白Occludin和E-cadherin蛋白表达显著增加。提示6-姜烯酚能逆转人鼻咽癌细胞的上皮-间质转化，抑制其迁移。

由这些结果可推测6-姜烯酚通过逆转鼻咽癌细胞的上皮-间质转化，从而抑制其增殖和迁移并诱导其凋亡。因此，我们认为6-姜烯酚是潜在治疗鼻咽癌的中药有效成分，或可成为鼻咽癌治疗的研究新方向，但其具体的分子机制和应用仍需进一步研究。