丙泊酚诱导新生大鼠少突胶质细胞的凋亡：基于激活caspase家族蛋白和抑制抗凋亡程序

纪雪霞，朱 毅，张登文，蔡宇晶，周国斌

南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）麻醉科，广东 广州510080

随着婴幼儿手术数量的逐年增长，婴幼儿麻醉数量也迅速增加。麻醉药物是否会影响幼儿的大脑发育，成为患儿家长和麻醉医师最关注的问题［1］。丙泊酚是婴幼儿实施麻醉和镇静最常用的静脉药物之一［2］。关于其对发育中大脑的毒性作用研究，近年来不断呈现新的研究成果。啮齿类动物研究证实，丙泊酚可诱导出生后7天新生鼠神经元凋亡，引起学习、记忆能力损害［3-5］。其机制不仅与丙泊酚诱导神经元凋亡相关［6］，还可抑制抗凋亡程序的启动［7］，最终导致凋亡增多。

在大脑发育过程中，除了神经元细胞，神经胶质类细胞也是重要结构，对神经发育及神经系统功能发挥重要作用［8］。有研究显示，孕期猕猴持续接受丙泊酚腹腔注射，可诱导胎儿及新生猕猴大脑少突胶质细胞（OL）的凋亡［9］。也有研究证实丙泊酚可诱导出生后7 d新生鼠OL凋亡，且趋势呈剂量依赖性增高［10］。可见丙泊酚诱导OL细胞凋亡是其产生毒性作用的又一个重要机制。然而目前尚无丙泊酚诱导OL凋亡原因的相关研究。Caspase家族是调控细胞凋亡程序的关键环节［11］，研究证实丙泊酚介导的细胞凋亡与caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性升高密切相关［12-14］。OL凋亡是否与caspase-3、caspase-8和caspase-9的激活相关，值得探索。有研究认为NGF/PI3K/Akt通路的激活在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作用［15］，而丙泊酚的促凋亡作用是否与此通路活性降低相关？本研究拟从促凋亡信号传导通路及抗凋亡信号通路两个方面探讨丙泊酚诱导OL凋亡的分子机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

出生后7 d（P7）SD乳鼠，雌雄不限，体质量18～21 g，由南方医科大学动物实验中心提供。

1.2 主要药品和试剂

丙泊酚（得普利麻，10 mg/mL，AstraZeneca UK Limited），中长链脂肪乳（华瑞制药有限公司），逆转录试剂盒（TaKaRa），qRT-PCR 试剂盒（TaKaRa），qRTPCR 引物（上海生工股份有限公司），小鼠抗大鼠Active caspase-3单克隆抗体（Bioss，bsm-33199M），兔抗大鼠Cleaved caspase-3 多克隆抗体（Bioss，bs-0081R），兔抗大鼠P-PI3K抗体（Cell Signaling），兔抗鼠P-AKT抗体（Cell Signaling），兔抗大鼠β-actin多克隆抗体（Bioss，bs-0061R），qRT-PCR 仪（Roche，LC480），全自动荧光显微镜（Olympus，BX63）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 采用随机数字表法将45只P7SD乳鼠分为3组：对照组（n=15）、脂肪乳剂组（n=15）、50 mg/kg丙泊酚组（n=15）。丙泊酚组按照体质量计算给药量后腹腔注射丙泊酚，0.4 mL/只，体积不足者采用生理盐水补齐。对照组和脂肪乳剂组腹腔注射等体积的生理盐水和中长链脂肪乳。将处于麻醉状态的乳鼠放入37 ℃充氧恒温箱中，密切观察乳鼠肤色和呼吸频率。给药8 h后采用1%的戊巴比妥8 μL/g腹腔注射，深麻醉后取标本。本研究已通过本院动物伦理委员会伦理审批（伦理号：KY-Z-2022-098-01）。

1.3.2 qRT-PCR 检测caspase-3、caspase-8 和caspase-9 mRNA和NGF mRNA的转录水平 根据RNA提取试剂盒说明提取脑组织总RNA，测量其纯度和浓度。然后取适量RNA进行逆转录得到cDNA。按照TaKaRa试剂盒操作指南进行加样扩增。

反应体系为：预变形，95℃30 s；扩增，95℃5 s，60℃30 s，共40个循环；冷却至50℃。引物序列：caspase-3上游引物：5'-TCCACGAGCAGAGTCAAAGG-3'，下游引物5'-AACAAGCCAACCAAGTTCACA-3'；caspase-8上游引物：5'-ACAGCATAGGTTCTCGAGGGAGA-3'，下游引物5'-AAAATCGGCACGACAGGTGTGACG-3'；caspase-9 上游引物：5'-GTGGTATTAGAGAGCTG TCAC-3'，下游引物：5'-GCGCG AGGGACTCAATGC GTAA-3'；NGF上游引物：5'-TGCCAAGGCGCAGCT TTTATC-3'，下游引物：5'-GTTTAGTCCAGTGGGCT TAGGG-3'；β-actin上游引物：5'-TGA CAGGATGCAG AAGGAGA-3'，下游引物5'-TAGAG CCACCAATCC ACACA-3'。以β-actin作为内参，所得Ct值计算出2-△△Ct来评价mRNA相对表达量。

1.3.3 Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9和p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平 提取大脑总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，计算上样量，每孔40 μg。配制15%SD-SPAGE凝胶，恒压电泳后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜1次后分别加入一抗稀释液，4 ℃恒温摇床孵育过夜。第2天洗膜后加入二抗稀释液（HRP 标记山羊抗兔IgG，1∶15 000），室温下孵育1 h。采用ECL发光试剂盒发光、显影，使用凝胶成像系统采集图像。图像采用Image J软件处理分析目标条带的灰度值。一抗分别为：caspase-3 一抗稀释液（1∶1000），caspase-8 一抗稀释液（1∶1000），caspase-9一抗稀释液（1∶1000），β-actin多克隆抗体一抗稀释液（1∶2000），p-PI3K一抗稀释液（1∶1000），p-Akt（1∶1000）。

1.4 统计学分析

采用SPSS21.0软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚对caspase-3、caspase-8 和caspase-9 mRNA表达水平的影响

检测丙泊酚暴露8 h后每组乳鼠脑组织促凋亡通路相关因子mRNA表达水平，结果显示：与对照组相比，丙泊酚暴露组caspase-3、caspase-8 和caspase-9 mRNA表达水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。脂肪乳剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05，图1）。

图1 丙泊酚对caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表达的影响Fig.1 Effect of propofol on caspase-3,caspase-8 and caspase-9 mRNA expressions in neonatal rat brain tissues.*P<0.05 vs control group.

2.2 丙泊酚对caspase-3、caspase-8 和caspase-9 蛋白表达水平的影响

与对照组相比，丙泊酚暴露组活化的caspase-3、caspase-8和caspase-9 蛋白表达水平均增高，差异有统计学意义（P<0.05）。脂肪乳剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05，图2）。

图2 丙泊酚对caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白表达的影响Fig.2 Effect of propofol on caspase-3,caspase-8 and caspase-9 protein expression in neonatal rat brain tissues.*P<0.05 vs control group;C:Control;F:Fat emulsion;P:Propofol.

2.3 丙泊酚对NGF mRNA和P-PI3K/Akt表达的影响

检测NGF mRNA表达水平，结果显示：与对照组相比，丙泊酚组NGF mRNA表达下降，差异有统计学意义（P<0.05，图3C）。脂肪乳剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。检测P-PI3K/Akt表达水平，结果显示：与对照组相比，丙泊酚组P-PI3K和P-Akt表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05，图3A、B）。脂肪乳剂组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

图3 丙泊酚对NGF mRNA，P-Akt，P-PI3K 表达的影响Fig.3 Effect of propofol on NGF mRNA,P-Akt,P-PI3K expression.A：Effect of propofol on NGF mRNA expression;B:Effect of propofol on P-Akt expression;C:Effect of propofol on P-PI3K expression.*P<0.05 vs control group;C:Control;F:Fat emulsion;P:Propofol.

3 讨论

丙泊酚是否会影响婴幼儿神经系统发育，一直是患儿家长和麻醉医师高度关注的问题。研究多次或反复接受全身麻醉的幼儿之后出现学习、认知功能障碍的风险增高［15,16］；但也有研究证实两者之间并无相关性［17,18］。动物研究证实，丙泊酚可引起大鼠学习记忆能力下降，其机制不仅与促凋亡程序激活相关，同时还抑制抗凋亡程序［3,6,7］。本研究也得出一致结论，麻醉剂量丙泊酚不仅引起乳鼠caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA 和蛋白表达水平升高，还导致NGF mRNA 和P-PI3K/P-PAkt表达水平降低，提示丙泊酚可能通过激活凋亡程序中caspase家族蛋白成员和抑制抗凋亡程序，诱导OL的凋亡。本研究结果不仅为丙泊酚神经毒性作用研究提供新的研究数据，也为临床应用提供新的理论依据，具有重要意义。

细胞凋亡是在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联激活的主动性细胞死亡过程。触发凋亡信号转导途径分为外部死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径［19］。在这些途径中，caspase家族蛋白酶起着关键作用，是执行凋亡的最终途径［20］。其中caspase-8和caspase-9发挥启动子效能，能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的caspase-3，触发细胞凋亡［21］。研究发现，无论是亚临床麻醉剂量（25 mg/kg）还是不同麻醉剂量丙泊酚（50 mg/kg和100 mg/kg）均可引起7 d乳鼠OL凋亡，并伴随caspase-3 mRNA和蛋白表达的升高，提示丙泊酚诱导的OL凋亡与caspase家族蛋白表达升高相关［10］。Zou等［22］证实，丙泊酚可通过激活caspase-3、caspase-8和caspase-9引起新生神经干细胞的凋亡。本研究采用50 mg/kg 丙泊酚剂量探讨其诱导OL 凋亡的分子机制，结果表明，caspase 家族的caspase-3、caspase-8 和caspase-9 mRNA的表达均明显升高。本研究进一步检测了caspase家族的蛋白表达水平，结果与mRNA表达上调一致，caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表达也明显增高，提示凋亡信号通路的激活是丙泊酚诱导OL凋亡的机制之一。OL是神经系统中成髓鞘神经胶质细胞［23］，其数量下降，MBP表达异常，均可导致认知功能障碍、语言减弱等［24,25］。探讨OL凋亡的机制具有重要意义。然而，经典的细胞凋亡途径，包括细胞表面死亡受体途径和线粒体引发途径［26］，其触发机制除了caspase家族蛋白的参与，细胞色素C、Bax、Bcl-2和死亡信号蛋白（TNF-2、FasL）等都发挥了关键的调控功能。因此，丙泊酚对这些凋亡程序相关蛋白的影响，值得进一步探索。

除了凋亡程序，在生物体适应环境变化，维持生理平衡的过程中，抗凋亡程序也发挥了重要作用［27］。抗凋亡也是多样性、偶联性和多途径的信号转导过程。其中，激活PI3k/Akt是促进抗凋亡作用的重要调节因子［28,29］，其过量产生可抑制细胞的凋亡。有研究发现，心脑通络液预处理联合针刺后处理的心肌保护作用（心肌细胞凋亡减少）通过PI3K/Akt通路介导实现［15］。也有研究证实了PI3K/Akt通路参与细胞抗凋亡的过程［30］。因此，丙泊酚诱导的OL细胞凋亡是否与PI3K/Akt磷酸化异常有关，引起我们关注。本研究发现，丙泊酚暴露后7 d乳鼠P-PI3K和P-Akt的表达水平减低，提示丙泊酚诱导的OL凋亡可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活性相关；进一步，我们检测了PI3K激动剂，NGF的表达情况，发现NGF的表达水平下降。由此我们推测，丙泊酚通过抑制NGF的表达，下调PI3K/Akt通路活性，导致抗凋亡程序受到抑制，最终引起OL的凋亡增多。研究结果与既往研究［31］结论一致，NGF激活PI3K/Akt通路，可明显减少OL 凋亡，起到脑保护作用。因此，丙泊酚下调NGF/PI3K/Akt通路活性，抑制抗凋亡程序的启动，可能是其导致凋亡增多机制之一。

综上，本研究从细胞凋亡和抗凋亡程序两个方面，探讨了丙泊酚诱导OL凋亡的分子机制，结果表明，丙泊酚可上调凋亡启动程序关键因子caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达；同时下调抗凋亡信号通路NGF/PI3K/Akt的活性。提示丙泊酚诱导OL凋亡不仅和凋亡程序被激活相关，抗凋亡程序的抑制也发挥重要作用。