高同型半胱氨酸通过Notch11/Hes1信号通路促进HT22细胞自噬和凋亡

张竞文，何 静，米晓娟，许贤瑞，田 英，燕 茹

宁夏医科大学1基础医学院//国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，2总医院，宁夏 银川750004

高同型半胱氨酸血症（HHcy）是人类最常见的代谢异常之一［1-3］，损害老年人、携带者和神经退行性疾病患者的认知和神经功能［1,4,5］，是痴呆的一个独立危险因素［4,6,7］。除此之外，HHcy也与高血压、糖尿病等心血管和代谢性疾病有关［1,4,6］，HHcy也是2型糖尿病患者发生微血管病变的独立危险因素［6,8］。了解HHcy所致损伤及其分子机制，将有助于HHcy所致疾病的预防和治疗［6,8］。

HHcy导致认知功能和神经功能损伤的机制尚不清楚［9,10］。研究提示［10-12］，HHcy具有兴奋性神经毒性作用，通过激活NMDA 受体或减少突触前膜对谷氨酸再摄取，引发谷氨酸的兴奋性毒性，导致脑损害的发生［13,14］。HHcy导致DNA甲基化异常［15,16］，诱导细胞凋亡［17,18］。Hes（hes）基因家族包括Hes1～Hes7七个同源基因，可分为激活型、抑制型两大类［19］。Hes1、Hes5属于抑制型基因，具有特征性的碱性螺旋-环-螺旋［20］，Notch 信号通路调节Hes1、Hes5 的表达［20,21］。Hes1、Hes3和Hes5调节神经干细胞的增殖和分化［19,21］。前期动物实验研究可见，HHcy可降低嗅球和大脑神经元HES1 和HES5 的 表达［18,22］。但是，HHcy 是否通 过Notch1/Hes1信号通路参与自噬和凋亡调节尚不清楚。

根据microRNA基因芯片测序分析可见，Notch信号通路为差异miRNA富集的候选通路之一，同型半胱氨酸可作用于细胞凋亡、自噬、生长等［5,11,13］。本研究将以HT22小鼠海马神经元细胞系作为研究对象，采用同型半胱氨酸进行共培养，制备高同型半胱氨酸血症体外模型。通过细胞学、电子显微镜、流式细胞术、Western blot、Real-time PCR等技术，检测Hes1、Hes5、Jagged1、Notch1、Bcl-2、Bax、P62、LC3I、LC3II 的表达，探讨HHcy对神经细胞自噬和凋亡的影响及其Notch1/Hes1信号通路的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、BCA试剂盒、5×电泳上样缓冲液、蛋白marker 等（凯基生物）。兔抗Hes1、兔抗Hes5、兔抗Jagged1、兔抗Notch1、兔抗bax、兔抗bcl2（Abcam），多克隆抗P62（Cell signal）、Beclin-1（Proteintech）、LC3（Proteintech），βactin、CCK8等（康为世纪生物）。HT22细胞（Procell）由宁夏颅脑疾病重点实验室-国家重点实验室培育基地馈赠。同型半胱氨酸（Hcy）、叶酸（Folic acid）、维生素B12（Sigma）等（国药集团）。

应用Primer8.3 软件设计针对Hes1等mRNA的引物探针。Primer3 网址：http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/Primer3，BLAST 网址：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。引物顺序为(5'-3',3'-5')。GAPDH:CCTCGTCCCGTAGACAAAATG,TGAGG TCAATGAAGGGGTCGT;Hes1: CACGACACCGG ACAAACCA,GAGGTGCTTCACAGTCATTTCCA;Hes5: TACCTGAAACACAGCAAAGCCT,GGCCGC TGGAAGTGGTAAA;Notch1: CTTCGTGCTCCTG TTCTTTGTG,TCTTCGTCTCCCCACTCGTTCT;Jagged1: TCTACATAGCCTGTGAGCCTTCC,TCAC CAAGCAACAGACCCAAG;P62: GACAAGAGTAA CACTCAGCCAAGCA,TCCATCTGTTCCTCTGGC TGTC;LC3: ATCATCGAGCGCTACAAGGG,AGCC GAAGGTTTCTTGGGAG;beclin 1: GAGATTGGAC CAGGAGGAAGCT,GTGCCAAACTGTCCGCTGT G;Bcl2:TGACTTCTCTCGTCGCTACCGT,CCTGA AGAGTTCCTCCACCACC;Bax: GCCTTTTTGCTA CAGGGTTTCAT,TATTGCTGTCCAGTTCATCTCC A;β-actin:GCTGTCCCTDTATGCCTCTG,TTTGATG TCACGCACGATTT。引物由上海生工生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞复苏后，接种于培养瓶内贴壁生长，置于37 ℃，5%CO2培养箱常规培养，培养液隔24 h更换。长至70%～80%时，制备细胞悬液传代培养。选择3～4代的细胞用于后续实验。采用CCK8试剂盒，检测细胞活力。

1.2.2 Hcy作用浓度筛选 Hcy浓度设定为0、20、50、100、200、500 μmol/L。根据CCK8检测结果，Hcy 100 μmol/L为最适浓度，培养48 h为最适时间。依此，本实验分组为：空白对照组（简称0组），高同型半胱氨酸组（简称100组），Hcy 100 μmol/L；高同型半胱氨酸维生素B干预组（简称100+fv组），Hcy 100 μmol/L+叶酸+维生素B12；空白对照+叶酸+维生素B12组（简称0+fv组）。

1.2.3 筛选Hes1 siRNA 将Hes1 siRNA干扰序列转染HT22细胞，培养48 h后，western blot检测Hes1蛋白表达，qPCR 检测Hes1 mRNA 水平。所用3 条片段：si-Hes1-373、si-Hes1-1227、si-Hes1-1292。根据Western blot、qPCR检测的结果，筛选出最优的Hes1 siRNA片段为si-Hes1-1292。其序列为：sense GAAUUUGGG AGCUGUUUAUTG，antisense AUAAACAGCUCCC AAAUUCTG。

1.2.4 Hes1重组质粒构建 以小鼠cDNA为模板，PCR扩增Hesl 基因，上下游引物分别为5'-GCCGATAT CGCCACCATGCCAGCTGATATAATGGA-3'和5'-TA ACTCGAGGC TCTCAGTTCCGCCACGGTCT-3'，目的片段约861 bp。将穿梭载体pAd-Track用EcoR V和XhoI双酶切后获得的骨架片段与Hes1基因片段连接，经测序验证，获得携带Hes1 的质粒。限制性内切酶EcoR I和XhoI双酶切，酶切片段为3720 bp和6182 bp，5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.5 Real-time PCR 采用Trizol 试剂盒提取总RNA，逆转录cDNA 合成，逆转录的反应体系总体积25 μL，42 ℃1 h，70 ℃5 min，已合成的cDNA放入-20 ℃冰箱保存。检测PCR 扩增产物；PCR 反应液置于FTC-3000 实时定量荧光Real-time PCR 仪上进行PCR 扩增反应。

计算机系统自动记录荧光信号，用ΔΔCt法统计：

A=ΔCt=Ct（待测样本目的基因）-Ct（待测样本内参基因）；B=Ct（对照样本目的基因）-Ct（对照样本内标基因）；K=ΔΔCt=A-B；表达倍数变化=2-K

1.2.6 Hes1 siRNA 转染细胞 转染细胞按说明书操作。取对数增殖期的细胞，按照每孔8×105/孔平铺在6孔板，稳定培养24 h；Lipofectamine 2000 分别与对应siRNA 预混配置成工作液，100 nmol/L，室温孵育25 min；待细胞生长融合度约50%时，更换siRNA预混工作液，继续37 ℃孵育1 d后更换含血清培养液，继续培养1～2 d；收集细胞，Western blot检测各组Hes1蛋白表达，筛选出最优的Hes1干扰片段。

1.2.7 统计分析 采用SPSS 20.0 软件分析。Student's检验和SNK检验，进行不同分组之间的两两比较，以P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长情况

培养48 h可见，各组细胞生长状况接近，细胞比较丰富（图1）。空白对照组（0组）胞体丰满、不规则形，片状生长，细胞可见突起（图1A）。高同型半胱氨酸组（100组）中死亡细胞明显增加（图1B），高同型半胱氨酸维生素B干预组（100+fv组，图1C）和维生素B组（0+fv组）可见少量死亡细胞（图1D）。

图1 HT22细胞生长情况Fig.1 Growth of HT22 cells in different groups.A:Scattered dead cells in blank control group.B:Increased dead cells in 100 μmol/L Hcy-treated cells.C:Scattered dead cells in 100+fv group.D:Scattered dead cells in 0+fv group.Scale bar=50 μm.

2.2 细胞凋亡

培养48 h后，Annexin V-FITC/PI流式细胞检测结果可见（图2），分别与0组（图2A）、100+fv组（图2C）和0+fv组（图2D）比较，高同型半胱氨酸组（图2B）凋亡细胞的比例均明显升高（图2E）；与高同型半胱氨酸组比较，100+fv组和0+fv组凋亡细胞比例明显降低（图2E）。

图2 HT22细胞凋亡检测结果Fig.2 Flow cytometry for detecting cell apoptosis in different groups.A: 0 group,B: 100 group.C:100+fv group.D: 0+fv group.E: Histogram of apoptotic proportion,*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group,n=3.

2.3 超微结构变化

透射电子显微镜观察可见，培养48 h，对照组细胞结构完整，线粒体、内质网等细胞器形态正常（图3A）；在Hcy 100 μmol/L 组，细胞结构基本完整，细胞质明显水肿淡染，线粒体肿胀、空泡化，可见多个自噬体（图3B）；在100+fv组，也可见线粒体肿胀、空泡化、自噬体，但程度轻于Hcy 100 μmol/L组（图3C）；在100+fv组，偶见自噬体（图3D）。

图3 HT22细胞超微结构Fig.3 Ultrastructure of HT22 cells in different groups.A:Normal mitochondria(M)in 0 group.B:Mitochondrial swelling,vacuolation(V),and increased autophagosome(AS)in 100 group.C:Autophagosomes(AS)in 100+fv group.D:Autophagosomes(AS)in 0+fv group.Scale bar=1 μm.

2.4 Western blot结果

Western blot结果显示（图4），在Hcy 100 μmol/L组，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2比值明显高于0组和100+fv组（P<0.05）；P62相对值在Hcy 100 μmol/L组明显低于对照组（图4，P<0.05），LC3II/LC3I比值在Hcy 100 μmol/L 组高于0 组和100+fv 组（P<0.05）；Beclin1在Hcy 100 μmol/L组未见明显变化(图4)。

图4 凋亡和自噬相关蛋白Western blot结果Fig.4 Western blotting of the proteins related with apoptosis and autophagy in different groups.A:Western blots of the proteins.B:Bar graph of Bax/Bcl-2 and LC3II/LC3I ratios.C:Bar graph of relative values of P62 and Beclin1.*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group;n=3.

HES1、HES5、Notch1 和Jagged1 蛋 白Western blot 结果可见（图5），在Hcy100 μmol/L 组，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达比值明显低于对照组（P<0.05），100+fv 组明显高于Hcy 100 μmol/L 组（图5，P<0.05）。

图5 HES1、HES5、Notch1和Jagged1 western blot结果Fig.5 Western blotting of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1 proteins in different groups.A:Western blots of the proteins.BE: Histograms of relative expressions of HES1,HES5,Notch1 and Jagged1,respectively.*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group;n=3.

2.5 Real-time PCR 检测结果

从P62、LC3、Beclin1的mRNA扩增结果可见（图6），Hcy 100 μmol/L 组LC3、Beclin1 的mRNA 明显高于0组和0+fv组，P62明显低于100+fv组（P<0.05），LC3和Beclin1的mRNA在高同型半胱氨酸组与100+fv组之间无显著性差异（图6D）。

HT22细胞Real-time PCR 检测结果显示，在培养48 h，高同型半胱氨酸组Hes1和Hes5 mRNA明显减少（图7），与0组、100+fv组和0+fv组比较，差异均有显著性意义（图7E，P<0.05）；高同型半胱氨酸组Jagged1无明显变化，100+fv组Hes1 mRNA明显高于高同型半胱氨酸组（图7E，P<0.05）。

图7 Hes1、Hes5、Notch1和及Jagged1 Real-time PCR检测结果Fig.7 Real-time PCR of Hes1,Hes5,Notch1 and Jagged1 in different groups.A: Hes1 mRNA amplification curve;B: Hes5 mRNA amplification curve;C: Notch1 mRNA amplification curve;D:Jagged1 amplification curve;E: Histogram of mRNA amplification;*P<0.05 vs 0 group;#P<0.05 vs 100 group.

2.6 Hcy对过表达和干扰Hes1后的影响

Western blot 检测可见，加入Hes1 干扰和过表达后，目标蛋白均有一定的变化（图8A）。Hcy组、Hes1 siRNA组和Hcy+Hes1siRNA组Hes1表达量明显低于对照组，且Hcy+Hes1siRNA 组又明显低于Hcy 组和Hes1 siRNA组（图8B）；而Notch1表达量无显著性差异；Jagged1表达量在Hcy组和Hcy+Hes1siRNA组明显降低，而Hes1 siRNA组高于Hcy组和Hcy+Hes1siRNA组（图8B）。

图8 Hcy对过表达和干扰Hes1后的影响Fig.8 Effect of Hcy on Hes1,Notch1 and Jagged1 expressions in HT22 cells with Hes1 overexpression and knockdown.A:Western blots of the proteins.B:Histogram of relative expression levels of the proteins.*P<0.05 vs con and si-NC groups,respectively;#P<0.05 vs Hcy group;n=3.

3 讨论

高同型半胱氨酸血症（HHcy）与神经和精神健康的改变有关，如认知障碍、抑郁症、中风和神经退行性疾病［3,19,24］。实验研究提示，HHcy能够导致脑组织损伤和神经细胞凋亡［18,22］、神经细胞自噬［22,23］。本研究显示，在HT22细胞，同型半胱氨酸100 μmol/L培养48h后，凋亡细胞的比例明显升高，细胞水肿、线粒体肿胀空泡化、自噬体增加；采用叶酸和维生素B12干预后细胞凋亡比例和细胞自噬明显降低。结果提示，高同型半胱氨酸能够诱导HT22细胞超微结构损伤、自噬上调及细胞凋亡。该结果与前期ApoE-/-高同型半胱氨酸小鼠体内研究基本一致［18,22,25］。

研究表明，HHcy在体内外均能诱导细胞凋亡［12,22］。然而，其中的作用机制尚不清楚。在本研究中，通过Western blot和real-time PCR 检测可见，同型半胱氨酸100 μmol/L培养48 h后，Bax基因表达明显增加，而Bcl-2基因表达则明显抑制。结果提示高同型半胱氨酸可通过bax/bcl-2途径引起细胞凋亡。实验研究发现，HHcy诱导小鼠神经细胞凋亡［22,25］。在衰老和神经退行性变过程中，可见神经元凋亡和自噬增加［23,26］。细胞凋亡增加、储备细胞减少可能是许多疾病共同的致病基础［1,22,27］。

HHcy能够诱导小鼠神经元自噬和细胞凋亡，从而加重神经元损伤［23,28］。作为自噬促进剂，HHcy可诱导大鼠脑缺血再灌注后LC3b/Beclin-1表达上调，自噬体积累，加重神经元损伤［22,28］。本研究结果显示，在同型半胱氨酸100 μmol/L 组，P62 相对值明显低于对照组，LC3II/LC3I比值明显高于对照组和干预组，这些变化与线粒体肿胀、空泡化、自噬体增加相一致。P62蛋白与蛋白质的运输和降解有关，表达下调时，自噬被激活［23,28］。关于HHcy引起神经细胞自噬增加的途径和机制尚不清楚［15,16］。HHcy 可抑制S-腺苷甲硫氨酸的生物合成，导致DNA低甲基化，抑制细胞生长［1,15,28］。

由HHcy引起的多种毒性作用可能与神经元再生耗竭有关［13,25,31］。本研究显示，同型半胱氨酸100 μmol/L处理的HT22细胞，HES1、HES5、Notch1和Jagged1蛋白表达降低。提示高同型半胱氨酸可下调Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1的表达。动物实验研究结果提示，在HHcy 所致神经元损伤和认知障碍中，存在HES1 和HES5表达降低［18,22,25］。

在HHcy状态下，对于Notch/Hes/Rbpj信号通路以及Hes1、Hes5、Notch1和Jagged1神经元表达下调的意义和机制知之甚少，将需要更多的研究进行证明。Hes1andHes5基因是Hes基因家族的主要成员，作为转录激活因子参与神经元分化［20,21］。研究提示［27,29,30］，Wnt/β-catenin和Notch信号通路与神经元干细胞动力学的调节密切相关；在神经干细胞中，Wnt和Notch信号通路参与了hNPCs 的调节［21,27］。在Notch/Rbpj 信号传导通路中起主导作用的Hes1和Hes5，在HHcy 小鼠的额叶皮层神经元和大脑中表达下调，可能抑制了Notch/Hes/Rbpj信号通路的作用［22,25,32］。