丽水白云山和南明山及周边地区可培养大型真菌的鉴定*

刘 昆，吴春玲，宋小亚，蒋 俊，路新彦，应国华

（丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000）

我国约有大型真菌资源17 000 种，仅有少量类型被发现，大部分类群尚未发现[1]。我国有可食大型真菌近1 000 种，可商业规模栽培的仅60 种左右，大量大型真菌资源未被挖掘利用[2]。野生资源需要经过分离、鉴定、驯化栽培，才能将其由野生生长状态变为可人工栽培的状态。从大型真菌的无性、有性组织或其生长基质中分离到的菌丝体，是食（药）用菌产业开发利用的基础。但由于野外环境复杂，容易滋生多种真菌，因此分离过程中常因其他丝状真菌的影响而出现分离错误、菌种污染等情况，造成培养的菌株与最初标本不符，从而影响后续驯化利用。因此，明确分离培养所获得菌株的准确名称，是后续研究的基础。

丽水市地处浙江省西南端山区，位于118°41′～120°26′E，27°25′～28°57′N，面积1.73 × 106hm2，境内90%以上地区是山地，分布有瓯江、钱塘江、闽江、飞云江、灵江、福安江等众多水系，以中亚热带海洋性季风气候与丘陵山地立体气候为主，森林覆盖率为81.7%，是华东的重要生态屏障，物种多样性居全省之冠[3]。得天独厚的自然资源与气候条件，孕育出丰富的物种和植被类型。大型真菌作为丽水市生态循环的分解者，在生态平衡中占有不可或缺的地位，是生物多样性的重要组成部分。对丽水市野生大型真菌资源进行调查，摸清资源概况，不仅有益于当地生态环境，也可为大型真菌资源保护利用提供理论基础。

目前，在海南、山东、贵州等地均开展过大型真菌资源的调查研究，期望大型真菌资源在生态保护、农业资源利用、食品药品生产等方面发挥作用。如MA 等[4]对海南的木腐大型真菌资源进行了报道，共发现702 种木生大型真菌，包括食用菌22 种、药用菌71 种、有毒蘑菇6 种。王敏等[5]、邓春英等[6]分别对贵州省内的食用菌与有毒蘑菇资源进行调查，共发现481 种野生食用菌，140 种有毒蘑菇。苏阳等[7]报道，山东省有大型真菌资源557 种，其中食用菌118 种、药用菌184 种、食（药） 兼用菌57 种。据文献记载，自1980 年起，丽水市已经开始对大型真菌资源进行调查，但当时仅收集了部分木腐菌标本，并未对生态环境、真菌生活习性、有毒蘑菇的危害及价值进行详细研究[8]。1997 年，孙培基等[9]报道，浙西地区（包括浙江泰顺县） 有大型真菌468种。2012 年，顾新伟等[10]调查显示，浙南山区（包括永嘉县、文成县、泰顺县） 拥有大型真菌1 100多种。近年来，随着资源调查方法与标本鉴定技术的迅速更新，部分学者开始利用网络化调查与分子鉴定技术对丽水辖区内的大型真菌资源进行更加详细与科学的研究。如赵端林等[11]在景宁县的望东垟、大仰湖2 个保护区内采集标本1 018 份，鉴定出195种大型真菌，包括8 个国内新记录种和4 个新种或新亚种。孙其伟等[12]在庆元县采集到标本286 份，鉴定出149 种大型真菌。赵承刚等[13]对缙云县境内大型真菌进行调查，获得标本203 份，鉴定出132个种。但关于丽水白云山与南明山两地大型真菌资源分布情况未见相关报道，对两地可培养大型真菌资源的相关研究也较少。试验通过对白云山、南明山及周边地区可培养野生大型真菌资源进行分子生物学与形态学鉴定，明确其分类地位，评价其利用价值，以期为今后的驯化栽培和资源开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 野外调查与菌株采集

白云山与南明山分别位于丽水市城区北侧与南侧，占地面积分别为2 848 hm2、1 177 hm2，分别建有白云国家森林公园与南明山风景名胜区，生态环境良好。两地年平均气温为18 ℃左右，4 月～10 月为雨季[14-15]。对白云山、南明山两地采用踏查法开展大型真菌野外调查与样品采集[16]，时间主要集中在2010 年至2021 年间每年的5 月至9 月。并对庆元的百山祖和五岭根、云和凤凰山、景宁渔际坑、松阳箬寮原始林等地进行适时采集。采集时记录采集编号、地点、时间、植被类型；新鲜子实体形状、大小、颜色、气味、伤变情况、生长基质等内容，并使用数码相机进行图片拍摄。新鲜样品采集后带回实验室进行分离、干制与保存。

1.2 菌株干制与菌丝体分离

新鲜子实体连同采集标签一同放入报纸中，在45～50 ℃条件下烘干，用于标本保藏与显微观察。

新鲜子实体表面使用75%酒精进行消毒后，将子实体切开（耳状子实体撕开子实层），使用手术刀切取部分子实体组织块，接种于含有抗生素的葡萄糖马玲薯琼脂（PDA） 平板中，于25 ℃条件下培养。期间及时观察和记录，待菌丝开始生长后切取菌落前端菌丝体进行纯化培养，连续纯化3 次。

1.3 菌株鉴定

采用ITS 序列比对与形态鉴定相结合的方法进行物种鉴定。对于保藏时间较久，只有菌丝体的菌株以分子生物学鉴定为主。

将纯化后的菌丝体接种到铺有赛璐酚膜的PDA平板中，25 ℃培养菌丝体。当菌丝长满平板或培养15 d 后收集菌丝体。使用北京百泰克公司的真菌基因组试剂盒提取总DNA。ITS 序列扩增引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。25 μL 扩增反应体系：2.5 μL 10 × Buffer，1 μL dNTP （2.5 mmol·L-1），上下引物各1 μL （10 μmol·L-1），0.3 μL Taq 酶（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，18.2 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果为单一条带的PCR 扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行TA 克隆测序。使用NCBI 数据库中的BLAST 在线程序对所获得的序列进行比对分析。

形态学观察包括采集过程所记录的宏观形态，以及菌盖表皮、担子、孢子、囊状体等显微结构特征。将ITS 比对结果与形态特征结合进行物种鉴定，两者结果一致判定为有效分离菌株，鉴定结果不一致的判定为无效分离菌株。对于仅有菌种的菌株，查阅相关书籍文献，根据分子鉴定结果与菌丝形态判断是否为有效分离菌株。

1.4 菌株种名确定

根据第十版Dictionary of the Fungi （《真菌词典》）[17]分类系统确定分类地位。物种的拉丁学名以真菌物种数据库Index fungorum[18]收录的最新名称为准。中文名称参考《中国大型菌物资源图鉴》[19]和《中国生物多样性红色名录-大型真菌卷》[20]，以及戴玉成[21]、李熠[22]、李增智等[23]、段东娥[24]、MONGKOLSAMRIT 等[25]、武英达等[26]、刘顺等[27]、李海蛟等[28]、郭婷等[29]所发表的相关文献进行确定。食用菌、药用菌、有毒蘑菇的确定参考戴玉成等[30-31]、图力古尔等[32]、李海蛟等[33]发表的相关文献。

1.5 统计分析

使用WPS 表格软件，对分类数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 有效分离菌株的分类统计结果

对2010 年至2021 年分离保藏的297 株可培养大型真菌菌株进行分离鉴定，共获得246 株有效分离菌株、占总数的82.8%；51 株无效分离菌株，占总数的17.2%。进一步对有效分离菌株进行分类统计，结果详见表1。

表1 有效分离菌株分类单元统计Tab.1 The total taxa of effective isolates

如表1 所示，246 株有效分离菌株隶属于担子菌门（Basidiomycota） 和子囊菌门（Ascomycota） 的5 纲12 目34 科70 属115 种。其中属于蘑菇纲（Agaricomycetes）、粪壳菌纲（Sordariomycetes） 的种类最多，分别有94 种（81.7%）、17 种（14.8%）。其余菌株属于花耳纲（Dacrymycetes）、盘菌纲（Pezizomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）。在目一级水平上，属于蘑菇目（Agaricales） 的菌株种类最多，有45 种，占总数的39.1%；属于多孔菌目（Polyporales） 的有36 个种，占总数的31.3%；属于肉座菌目（Hypocreales） 的有16 个种，占总数的13.9%。属于其他目的菌株种类占比较少，属于木耳目（Auriculariales） 的有3 个种、属于锈革菌目（Hymenochaetales） 的有3 个种、属于牛肝菌目（Boletales） 的有2 个种，属于花耳目（Dacrymycetales）、炭角菌目（Xylariales）、盘菌目（Pezizales）、格孢菌目（Pleosporales） 的则均仅有1 个种。

在科一级水平上对菌株进行统计，结果详见表2 （仅列出含有5 个种以上的科）。

表2 主要科的物种数量统计Tab.2 The dominant fungal families

如表2 所示，在科一级水平上，属于蘑菇科（Agaricaceae） 的有16 个种，占总数的13.9%；属于多孔菌科（Polyporaceae） 的有15 个种，占总数的13.0%；属于球盖菇科（Strophariaceae） 的有12 个种，占总数的10.4%；属于虫草科（Cordycipitaceae）的有10 个种，占总数的8.7%；属于拟层菌科（Fomitopsidaceae） 的有8 个种，占总数的7.0%；属于灵芝科（Ganodermataceae） 的有5 个种，占总数的4.3%；属于其它科的种数均在5 种以下。

在属一级水平上对菌株进行统计，结果详见表3 （仅列出含有5 个种以上的属）。

表3 主要属的物种数量统计Tab.3 The dominant fungal genera

如表3 所示，在属一级水平上，属于虫草属（Cordyceps） 的有8 个种，属于拟层孔菌属（Fomitopsis） 的有6 个种，属于栓孔菌属（Trametes） 的有5 个种，属于灵芝属（Ganoderma） 的有5 个种，属于蘑菇属（Agaricus） 的有5 个种。属于其它属的菌株占比较低，各属包含物种数均少于5 种。

2.2 食用菌资源评价结果

将丽水白云山、南明山等地分离的115 种246株有效分离菌株按食用价值进行分类，可分为食用菌、药用菌、有毒蘑菇和食毒不明蘑菇4 类。其中食用菌有23 种，占总种数的20.0%；药用菌有24种，占总种数的20.1%；有毒蘑菇有15 种，占总种数的13.0%；食毒不明的其它大型真菌资源61 种，占总种数的53.0%。

23 个记载可以食用的种类信息详见表4，部分子实体形态特征详见图1。

图1 部分食用菌子实体Fig.1 Fruit bodis of some of the collected edible fungi

表4 食用大型真菌种类Tab.4 Edible macrofungi species

如表4 和图1 所示，在23 种食用菌中，有13种可大规模人工栽培，分别为皱木耳、毛木耳、毛头鬼伞、牛舌菌、金针菇、卵孢小奥德蘑、花脸香蘑、白鬼笔、多脂鳞伞、白黄侧耳、糙皮侧耳、肺形侧耳、裂褶菌。褐黄木耳与毛木耳2 个种类的有效分离菌株均有6 个，在所有食用菌中，菌株分离数量最多。

2.3 药用菌资源评价

分析发现，有效分离菌株中共有药用菌种类24种，详细信息见表5，部分子实体形态特征见图2。

图2 部分药用菌子实体Fig.2 Fruit bodies of some of the collected medicinal fungi

如表5 和图2 所示的药用菌中，有13 种被报道可进行人工栽培，分别是粉虫草、高雄山虫草、细脚虫草、红贝俄氏孔菌、红缘拟层孔菌、树舌灵芝、南方灵芝、有柄灵芝、灵芝、白囊耙齿菌、蝉棒束孢、网纹马勃、云芝栓孔菌。

2.4 有毒蘑菇资源评价

所有有效分离菌株中，共有有毒蘑菇7 种，中毒类型有神经精神型和肠胃炎型2 种，详细信息见表6，子实体形态特征见图3。

图3 有毒蘑菇子实体Fig.3 Fruit bodies of poisonous fungi

表6 有毒蘑菇种类Tab.6 Poisonous fungi species

如表6 和图3 所示的有毒蘑菇中，可造成神经精神型中毒的种类有：白黄小脆柄菇、粪生光盖伞、热带紫褐裸伞、苏梅岛裸盖菇。可造成肠胃炎型中毒的种类有：大青褶伞、丛生垂幕菇、砖红垂暮菇。白黄小脆柄菇在所有有毒蘑菇中分离到的菌株最多，在莲都白云山、莲都南明山两地共分离到7 株。

3 讨论

根据利用价值，大型真菌资源可分为食用菌、药用菌、有毒蘑菇3 类。据统计，我国有食用菌近1 000 种，可实现商业化栽培的约有60 种[2]；药用真菌473 种，也仅有80 余种实现了人工栽培[30]。从数量来看，我国仍有大量的大型真菌资源可被开发利用。本试验中共获得可人工栽培的食用菌13 种，46个菌株，其中皱木耳、毛木耳、毛头鬼、牛舌菌、白鬼笔、多脂鳞伞、白黄侧耳、裂褶菌等种类在丽水市还未见较大规模栽培，可作为丽水食用菌产业未来发展的备选种类。在药用菌方面，试验获得药用菌24 种，102 个菌株，其中灵芝、树舌灵、南方灵芝、有柄灵芝、红缘拟层孔菌等种类可为药用菌产业提供新的资源，扩大本地以灵芝为代表的药用菌产业范围。对这些种类进行开发利用，可为本地的食（药） 用菌产业发展提供新的动力。近年，高雄山虫草与细脚虫草被修订为一个种——Cordyceps tenuipes，因对新分类系统的接纳有滞后性，此次仍以原数据库比对结果为依据进行分类，这也从侧面说明对其研究尚不充分[34]。

蘑菇中毒是我国最严重的食品安全问题之一，仅2022 年就发生蘑菇中毒事件482 次，1 332 人中毒，28 人死亡[35]。因此对毒蘑菇的种类、有毒成分、中毒类型等进行研究，有助于预防中毒事件，提高中毒治疗效果。试验分离到7 种有毒蘑菇，共15 个菌株，其中白黄小脆柄菇、粪生光盖伞、热带紫褐裸伞、苏梅岛裸盖菇可造成神经精神型中毒，大青褶伞、丛生垂幕菇、砖红垂暮菇可造成肠胃炎型中毒。但目前国内对这些有毒蘑菇研究多集中于资源调查，仅有少量与毒素相关的研究，如何对其进行开发利用还有待深入研究。

试验除对有效分离菌株进行分类鉴定外，还对51 株无效分离菌株进行了鉴定。多数无效分离菌株可根据分子鉴定结果及其菌落形态进行辨别，为以后野生大型真菌分离提供一定参考。但有些种类的真菌因菌落形态与多数大型真菌相近，出现分离错误也较难在早期发现。如小包拟盘多毛孢[Pestalotiopsis microspora （Speg.） G.C.Zhao & Nan Li] 的菌落白色浓密，生长速度中等[36]，菌落生长早期与其它大型真菌较难区分，易导致错误分离，但其生长后期有大量黑色液滴状分生孢子产生，可依据此特征进行辨别。又如白囊耙齿菌[Irpex lacteus （Fr.）Fr.]，其本身为一种常见的木腐真菌，菌落白色较薄，呈轻微升起的棉花絮状，生长速度较快[37]，以上特征与多数大型真菌类似，且具有分生节孢子，容易扩散引起污染，仅凭形态特征较容易导致分离错误，需要结合分子生物学数据、出菇性状等进行区分。