鹿茸菇高产菌种选育*

潘红英，宁天玉，许烨婷，周虹雨，徐 兵

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

鹿茸菇（Lyophyllum decastes） 学名荷叶离褶伞[1]，因其形状与中药鹿茸相似而得名。鹿茸菇富含膳食纤维、矿物质、缩氨酸和维生素，口感鲜美滑嫩，具较高的营养价值[2]。其子实体含有鹿茸菇粗多糖，具有抗肿瘤、降血压、降胆固醇、抵抗过敏原等功效，是一种特殊的食药兼用菌[3]。基于口感优势和营养价值，鹿茸菇的市场前景较好，目前我国的部分地区已经在生产基地实现了规模化栽培。但鹿茸菇菌种退化速度快，很难长期保持良好的性状特征，使得产量难以维持，这成为制约鹿茸菇产业健康、快速、可持续发展的关键因素[4]。近几年，随着菌种退化问题愈发严重，我国食用菌企业开始意识到应当重视并加强对菌种的保护和研发力度，不断开展优良菌种选育试验[5]。

结合鹿茸菇生产基地栽培情况，课题组选择了来自昆山、连云港、常熟3 个不同产地的菌种进行杂交，通过单孢杂交育种获得具有杂种优势的鹿茸菇杂合子新菌株，以期为我国鹿茸菇的工厂化生产提供优良菌种，助力我国鹿茸菇产业发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

鹿茸菇K，昆山青禾食用菌科技有限公司提供；鹿茸菇L，连云港中恒生态农业有限公司提供；鹿茸菇C，采摘于常熟虞山。

1.1.2 试剂

无水乙醇、蔗糖、氯化钠，中国国药（集团）上海化学试剂公司。

1.1.3 试验器材

M124A 电子天平，苏州恒商工业设备有限公司；LDZX-75KBS 高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SPX-250BIII 生化培养箱，上海仪天科学仪器有限公司；DZF-6020 恒温干燥箱，上海测博生物科技发展中心；SW-CJ-2F 超净工作台，上海川昱实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 单孢子的收集、分离

1） 孢子收集：选择新鲜、菇形完整、发育健壮的鹿茸菇子实体，在超净工作台内，用75%的酒精棉球对鹿茸菇表面进行消毒[6]，去除菌柄，将菌盖放入无菌的培养皿内，置于25 ℃恒温培养箱内。每个产地的菌株均设5 组平行试验，进行孢子的收集。

2） 单孢分离：恒温24 h 后，在每个培养皿中分别加入1 mL 生理盐水，轻轻摇晃培养皿，让生理盐水和皿底充分接触，以便形成孢子悬液。用移液枪从培养皿中吸出0.2 mL 孢子悬液，移入无菌PDA平板培养基中涂布均匀。每个处理设3 组平行试验共9 个培养皿，置于25 ℃培养箱内培养3 d。待孢子萌发后，镜检观察，将确认只有1 个孢子萌发的培养皿内的培养基切下，转接至试管斜面培养基中，25 ℃恒温培养至菌丝长满试管。

1.2.2 单核菌丝的鉴定

将斜面中的鹿茸菇单孢萌发菌丝接种在PDA 平板培养基上，每个平板上呈正方形接种4 个菌块。25 ℃恒温培养至菌丝长至1～2 cm，用显微镜对采集到的孢子菌丝进行观察。如果菌丝有锁状联合，判断该菌丝是双核菌丝；如果菌丝无锁状联合，则判断该菌丝是单核菌丝。将单核菌丝的单孢子转移至平板培养基中，25 ℃恒温培养12 d 后，观察菌丝生长情况。

通过划 “十” 字法测量菌落直径，菌丝的平均生长速度（V，mm·d-1） 的计算公式为：

V=（φ－6）/2×D

式中：φ 为菌落直径（mm）；D 为菌丝生长天数（d）。

1.2.3 单核菌株期的拮抗测定

3 个产地的鹿茸菇单核菌株首先采用两两组合的方法进行拮抗试验，即分别在各菌株菌落边缘菌丝生长旺盛的地方，用灭菌接种铲切取约1 cm×1 cm的菌种块，将两菌块接种于同一个PDA 平板培养基上，两菌块之间保持一定距离。接种后以封口膜封口，将平板倒置于25 ℃恒温箱内培养，培养过程中需及时剔除染杂菌的平板。待菌丝长满平板后，观察待测菌株在菌丝交界处是否出现拮抗反应。

1.2.4 单孢杂交方法

在同一个PDA 平板培养基上，随机挑选2 个长势较快的不同亲本的单孢菌株进行配对杂交，两接种块之间的距离约为2 cm。接种后用封口膜封好，放入25 ℃恒温培养箱中培养。当2 个接种块的菌丝生长至彼此接触时，在交界处切取约1 cm × 1 cm的正方形菌块，转接至新制的PDA 平板培养基上继续培养。待菌丝长满平板后，用无菌接种环挑取部分菌丝，用显微镜观察菌丝间是否出现锁状联合现象[7]。如未出现锁状联合现象，判断是由鹿茸菇单孢萌发生成的单核菌丝；出现锁状联合的确定为杂交形成的新菌株，将其转接至试管斜面培养基中，置于25 ℃恒温培养至菌丝长满试管[8]。

1.2.5 杂交菌株的拮抗测定

将获得的子代杂交菌株依次进行编号，2 个亲本和对应的杂交菌株采用等边三角形接种的方式，即分别切取杂交菌株和两亲本菌株的菌块，将3 个菌块接种于同一PDA 平板培养基上使之呈等边三角形分布，两两之间间隔2～3 cm。转接后的培养皿用封口膜封口，置于25 ℃恒温培养箱中培养，观察记录平板上的菌丝生长状况。待菌丝长满PDA 平板后，根据拮抗线来判断三者之间的亲缘关系。观察2 个亲本和杂交菌株在菌丝体交界处是否具有明显的拮抗现象，如有明显拮抗线，说明杂交获得的新菌株与亲本不是同种菌株。注意去除被杂菌污染的平板。

1.2.6 杂交菌株室内子实体诱导

将杂交菌株接种在PDA 平板培养基上，置于培养箱中25 ℃培养5 d，后转移至19 ℃恒温培养箱内培养，采用12 h 强光（3 000 lx） 光照加12 h暗光（无光照） 交替的方式进行光照刺激，诱导形成子实体。根据子实体形成情况保留结实能力好的杂交菌株，淘汰污染以及无结实能力的杂交菌株。每个杂交菌株进行3 个重复，25 ℃条件下恒温培养12 d 后，观察菌丝生长情况并计算菌丝平均生长速度。

2 结果与分析

2.1 单孢子的分离培养

2.1.1 单孢子的收集

经过孢子的收集、单孢子的分离和鉴定，共获得鹿茸菇K 单核菌株18 个，鹿茸菇L 单核菌株21个。经镜检后培养获得单核菌株39 个。

2.1.2 单核菌丝分离情况

单核菌丝分离情况详见图1 和图2。

图1 无锁状联合的单核鹿茸菇菌丝（40× 物镜）Fig.1 Mononuclear mycelia of Lyophyllum decastes without clamp connection (40× objective lens)

图2 有锁状联合的双核鹿茸菇菌丝（40× 物镜）Fig.2 Binuclear mycelia of Lyophyllum decastes with clamp connection (40× objective lens)

如图1 和图2 镜检结果显示，试验中采集到的单孢菌株中有37 个萌发出的菌丝无锁状联合，判断为单核菌丝；有2 个出现锁状联合，为双核菌丝。单核菌丝分离成功率约为95%。

2.2 单核菌株培养及亲本选择

2.2.1 单核菌丝生长情况

3 种鹿茸菇菌株的单核菌丝生长情况详见表1。

表1 3 种鹿茸菇菌株的菌丝生长情况Tab.1 Mycelial growth of three strains of Lyophyllum decastes

如表1 所示，3 种鹿茸菇菌株单核菌丝的平均生长速度由快到慢为L＞K＞C；鹿茸菇K 的菌丝最为致密，鹿茸菇L 和鹿茸菇C 的菌丝密度为稠密；3种菌株的菌丝颜色均为白色；鹿茸菇L 的菌落边缘整齐，鹿茸菇C 和鹿茸菇K 的菌落边缘较整齐。

2.2.2 单核菌株拮抗测定结果

3 种鹿茸菇单核菌株的拮抗情况详见表2 和图3。

表2 3 种鹿茸菇菌株间的拮抗试验结果Tab.2 Antagonistic relationship among three strains of Lyophyllum decastes

图3 鹿茸菇K 和L 菌株间拮抗测定结果Fig.3 Antagonism test results between strains K and L of Lyophyllum decastes

如表2 和图3 所示，3 种鹿茸菇菌株中，鹿茸菇C 和鹿茸菇K 菌株间拮抗最弱，鹿茸菇L 和鹿茸菇C 菌株间拮抗较强，鹿茸菇K 和鹿茸菇L 菌株之间拮抗最强。

2.2.3 亲本菌株的选择

根据3 种供试菌株的单核菌丝生长情况和拮抗试验结果，选择拮抗作用明显、菌丝生长状况较好、菌丝密度更为致密的鹿茸菇K 和鹿茸菇L 为亲本进行后续试验。

2.3 杂交菌株的鉴定和评价

2.3.1 杂交菌株生长状况和镜检结果

挑选长势旺盛的亲本单核菌丝进行两两配对，其中鹿茸菇K、L 单核菌株各8 个，总共获得了64个杂交组合，根据是否具有锁状联合和镜检菌丝生长状况，筛选得到优良杂交菌株41 个。以杂交菌株KL7 为例，与亲本的拮抗测定结果见图4。

图4 鹿茸菇杂交子KL7 的拮抗检测Fig.4 Antagonism detection of hybrid KL7 of Lyophyllum decastes

如图4 所示，筛选到的41 个杂交菌株中，有29个杂交菌株与2 个亲本之间具有明显的拮抗线，说明这29 个菌株为杂交获得的新菌株。在实验室内经过进一步的子实体诱导试验，根据是否能诱导生成子实体，筛选得到具有结实能力的杂交菌株15 个。

2.3.2 优良菌株筛选结果

对15 个具有结实能力的鹿茸菇杂交菌株进行菌丝培养，其菌丝生长情况详见表3。

表3 杂交鹿茸菇菌株菌丝生长状况Tab.3 Mycelial growth status of hybrid strain of Lyophyllum decastes

如表3 所示，综合菌丝密度、颜色及菌落边缘生长情况，筛选出生长良好的杂交菌株7 个，分别为：KL4、KL10、KL16、KL17、KL21、KL23、KL25。

对7 个杂交菌株进行出菇试验，最终获得3 株出菇情况较好的菌株，其子实体形态特征详见图5。

图5 优势杂交菌株子实体形态Fig.5 Fruit body morphology of dominant hybrid strains

如图5 所示，试验共筛选出子实体性状优良的杂交菌株3 株，分别为KL4、KL10、KL17。鹿茸菇杂交菌株KL4 菌盖呈暗褐色，菌柄呈浅褐色，有光泽；KL10 子实体菌盖形态完整，呈馒头形，无萎缩开裂；KL17 子实体表面光滑，菌柄浅褐色，完整无开裂，菌盖完整，富有鹿茸菇本身的清香，且生产周期最短。

3 讨论与结论

食用菌日益受到消费者的喜爱，因此食用菌产业发展迅猛，已经超过棉、茶、油等，逐渐成为中国种植业第五大产业[9]。食用菌育种是获得产量高、抗逆性强、品质高的新品种的常用手段。目前食用菌领域常用的育种方法主要有杂交育种法、单孢分离法、组织分离法、原生质体融合法、分子育种法、诱变育种法等[10-11]。

自然界中普遍存在的杂种优势现象，是指第一代杂合子比其亲本生长状况更好、品质更加优良。2 个亲本的亲缘关系越远，性状差异越大，所获得的杂交后代越可能具有优势。对于同种担子菌来说，在遗传特性不同的营养体间，会因为异体识别出现菌丝不亲合现象，称为拮抗反应，这种现象由多基因所控制[12-13]。将亲缘关系较远，基因组内异核体不亲合的2 株真菌菌株共同培养时，菌株间会产生拮抗反应。这一现象可以防止在遗传上具有明显差异的个体间出现菌丝融合，对于真菌保持个体遗传稳定具有重要意义。根据农业部发布的农业行业标准《食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应》（NY/T 1845-2010）[14]，2 个菌株之间亲缘关系的远近，可以通过观察2 个菌株菌落交界处菌丝间的拮抗反应特征来进行简单的判断。如菌落交界处呈现隆起型、沟型或隔离型则确定为有拮抗反应，可以判断2 个菌种为不同品种。

将3 种鹿茸菇单核菌株进行两两配对测定拮抗反应情况，从中选择了拮抗线明显、生理性状优良的“鹿茸菇K” 和 “鹿茸菇L” 作为杂交亲本。从中挑选出长势旺盛的单核菌丝进行两两配对，共获得了64 个杂交组合，根据是否具有锁状联合以及菌丝生长状况，筛选得到优良杂交菌株41 个，其中29 个杂交菌株与2 个亲本之间形成明显的拮抗线，通过实验室内诱导子实体形成的试验，根据子实体形成情况，得到具有结实能力的杂交菌株15 个。通过对这些菌株的再次筛选，获得菌丝生长情况良好的菌株7 个，通过出菇试验，最终筛选出子实体性状优良的菌株3个，分别为KL4、KL10、KL17；其中KL17 菌株子实体性状更为优良，生产周期最短。

通过杂交育种技术获得的杂交后代可能会出现各项性状明显优于亲本的杂种优势，但也可能出现生存能力下降的杂种劣势[15]。因此在杂交育种中需要进行大量的重复试验，才能筛选获得满足要求的优良鹿茸菇新品种。后期课题组将对杂交获得的新菌株在多地进行试验，反复验证性状是否能稳定遗传。再通过栽培技术的优化，以期获得高产、稳产的鹿茸菇人工栽培菌种。