花耳属1 个中国新记录种——Dacrymyces dictyosporus*

乔 婷，戴 璐，张黎光，刘 愚，霍文严，贺雪莲，祁 鹏，路鹏鹏，李峻志

（陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043）

花耳属（Dacryomyces） 隶属于花耳纲（Dacrymycetes） 花耳目（Dacrymycetales） 花耳科（Dacrymycetaceae），最早于1816 年由NEES 建立，当时只容纳了1 个单一的物种[1]。随着研究的深入，又发现了一些新种，其属内物种逐渐增多[2-5]。目前，根据真菌分类索引（Index Fungorum） 已经确定了114 个花耳属分类群，广泛分布于世界各地，主要集中于欧洲、美洲、亚洲和大洋洲[6-9]。花耳属中的物种相对混杂，其中包括了很多未分类于花耳科中其他属的类群[10]。随着分子生物学的发展，分类学家对花耳科物种的系统发育关系进行了重新评估，结果表明，花耳属物种具有高度多样性，但目前花耳属的几个类群和其他属之间的系统发育关系还未有很好的数据支持，而且用于区分不同分支的表型特征有较多重叠[11-12]。因此，在鉴定该属物种时需谨慎，避免分类混乱。

截至目前，有7 个花耳属真菌在中国被发现，包括Dacryomyces dendrocalami Oberw，Dacryomyces duii B.Liu & J.Z.Cao，Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian，Dacryomyces pengii （B.Liu & L.Fan） A.Savchenko，Dacryomyces Sichuanensis B.Liu& L.Fan，Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Yunnanensis B.Liu & L.Fan。但部分物种仅以形态学特征作为分类依据，缺乏分子生物学相关数据[5-6，13]。吴峰等[14]于2022 年首次结合形态学与分子生物学，鉴定了我国境内的2 个花耳属新种Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian，获得了中国花耳属样品的分子生物学数据，丰富了花耳属物种的多样性。

花耳属担子果呈无柄的枕状、角状，有时具柄，具有较均匀的菌丝结构，有两性膜或圆柱形中等分化的不育皮层，膨胀细胞比Heterotextus 少[15]。该属物种通常生长于死树、树桩、倒下的树干，或被子植物、裸子植物的树枝上，在木材分解过程中起关键作用，同时可引发褐腐病[16]。目前对花耳属物种的研究主要集中在分类学阶段，对其次生代谢产物及应用所知甚少。MIERAUV 等[17]从花耳属物种中分离获得2 种新的抗生素代谢物dacrymenone（1）和VM 3298-2 （2）；其中倍半萜类化合物dacrymenone（1） 表现出较弱的抗菌和抗真菌活性，而VM 3298-2 （2） 表现出细胞毒性和抗真菌活性。BULAT[18]为了解花耳属部分物种担子果呈现黄色或橙色的原因进行了研究，发现随着光照强度的增加，色素产生的速度加快，相同光照强度条件下，担子果颜色趋于一致。以上研究结果为后续开展花耳属物种代谢产物的研究提供了思路。

秦岭地区大型真菌资源丰富，但花耳属物种报道较少，通过对采自秦岭的1 份样本进行了形态学和分子生物学鉴定，结果显示该样本为Dacrymyces dictyosporus。这是首次在中国境内发现D.dictyosporus，因此确定其为中国新记录种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜Dacrymyces dictyosporus （中文名未定） 担子果样品，于2021 年11 月5 日采自陕西省宝鸡市太白县太洋公路 “K 14+500” 处的高山草甸（107°27′93.0″E，33°98′87.3″N，海拔2 089 m），编号为20210556。采集后置于硅胶中干燥，后将其保藏于陕西省微生物研究所秦岭菌物标本馆（SXIM） 中。

1.2 形态学观察

于自然环境下对子实体样本的宏观形态和生境进行拍照记录，并将其置于刻度板上，观察和记录担子果的形态特征，表面是否具附属物，受伤后是否变色。详细描述菌肉颜色、气味等特征。

1.3 显微形态学观察

将干燥的标本组织手动切片后，使用5%的KOH 复水，在光学显微镜下观察其显微特征。随机选取20 个成熟的担孢子、担子、皮层菌丝、内部菌丝进行测量和拍照。

1.4 分子生物学分析

1.4.1 DNA 提取及PCR 扩增

采集的样品带回实验室后立即取样放入DNA 保存液中。进行分子生物学分析时，从DNA 保存液中取出20 mg 新鲜担子果，在液氮中充分研磨，按照Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司） 提取DNA。使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 对基因组DNA 进行PCR 扩增。20 μL PCR 反应体系为：2×Mix 10 μL，上游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 5 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，30 个循环；72 ℃延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物。

1.4.2 DNA 纯化及测序

使用快速琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司） 对PCR 产物进行纯化回收，检测合格后送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.4.3 系统发育分析

使用DNASTAR 软件对双向测序结果进行质量检测和拼接[19]。将获取的ITS 序列在NCBI 中进行BLAST 比对，下载与之一致性较高的序列，以松乳牛肝菌（Suillus pictus） 作为外类群[20]，利用MEGA 5 软件中的最大似然法，以Kimura-2parameter 模型构建系统发育树，Bootstrap 为1 000 次。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

采集样本20210556 的形态特征详见图1。

图1 样本担子果形态Fig.1 The basidiocarp morphology of sample

如图1 所示，该菌担子果散生于树干表面，直径1～3 cm 不等。幼时脓包状、角状或枕状，呈透明至浅黄色；随着担子果生长，逐渐呈扇形，表面脑状，具柄。新鲜时多呈亮橙色至橙色，软胶质，干燥时橙黄色至暗橙色。其菌丝、担孢子显微结构见图2。

图2 样本显微结构图Fig.2 Microstructure diagram of sample

由图2 可知，担子果幼时皮层相对清晰，内部菌丝具细长的管腔，隔生，无明显锁状联合。担子棍棒状近圆柱形，大小为（31～58）μm ×（6～10） μm，成熟后出现分叉；担孢子宽，呈钝梭形、蚕蛹形、梨形；顶端通常有小突起，具1～7 个横隔，经5%的KOH 处理后呈黄色；大小为 [（15.2） 19 ～22（26.5）] μm × [（6）8～10 （11）] μm，平均长为20.2 μm，平均宽为8.6 μm，Q 值（担孢子平均长度与宽度之比） 为2.35。担孢子可通过胚管萌发，呈罕见的近球形至宽卵形，大小为（17.0 ～19.5） μm ×（11.5～13.0） μm。

根据形态学特征，初步将该物种鉴定为Dacrymyces dictyosporus。该种主要分布于美国、日本、新西兰、中国等。常于秋季散生于针叶林裸子植物腐木上。

2.2 系统发育分析结果

基于花耳属12 条ITS 序列（其中11 条序列来自GenBank），以松乳牛肝菌1 条序列（序列编号为AY854069.1） 为外类群构建的系统发育树见图3。

图3 基于ITS 的系统发育分析Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如图3 所示，试验样品20210556 与日本和美国报道的D.dictyosporus （AB712454.1，MK050629.1）序列聚为一支，且支持率高达98%；同时与该属较相似物种D.chrysospermus 的5 个序列处于不同分支。因此在分子水平上能将Dacrymyces dictyosporus与相似物种D.chrysospermus 明显区分开。系统发育分析结果与形态学鉴定结果一致。

3 结论与讨论

对采自秦岭的1 个真菌物种的形态学特征进行了详细描述，并结合分子生物学手段进行综合鉴定，显示该样本为Dacrymyces dictyosporus。通过文献检索发现，D.dictyosporus 是首次在中国境内被发现，因此确定其为中国新记录种。

D.dictyosporus 是花耳属一个独特的物种，其担子果大，厚壁盘孢子，无锁状联合[8，20]。根据新鲜担子果的宏观形态特征，样品与金耳、Tremella mesenterica 相比，其担子果形状、颜色、质地等方面较为相似，但担子和担孢子的形状、大小、内部菌丝是否有锁状联合等方面差异较大。如D.dictyosporus 是由单型菌丝组成，其担孢子主要呈钝梭形、梨形，大小为[（22.5）25～28 （30）] μm ×[（9）10～12（13.5）] μm[21]；而金耳和T.mesenterica均是由自身菌丝和寄主菌丝形成二型态菌丝结构。金耳的酵母状分生孢子多呈亚球形、宽椭球形，大小为[8.3～9.5（9.7）] μm × [6.8～7.6（8.0）] μm；T.mesenterica 的担孢子宽，呈椭球形，大小为[13～16（22）] μm ×[9.3～10.6（12.1）] μm[22-23]。

D.dictyosporus 与掌状花耳（D.chrysospermus）形态特征十分相似，尤其是担子果及担孢子的结构，均会出现少数近球形担孢子，但担子果的形状和大小及菌丝锁状联合方式不同。