羊肚菌新品种“皖羊肚菌1 号”选育*

储甲松，朱加保**，徐道青，路献勇，郭永乐，王为联，唐 峰，王亚会，王红娟，吕 宇，王玉娇

（1.安徽省农业科学院棉花研究所，安徽 合肥 230041；2.安徽乐永园农业科技有限公司，安徽 宿州 234215；3.灵璧县种子管理站，安徽 宿州 234299；4.灵璧县农业农村局，安徽 宿州 234299：5.安徽省农业科学院园艺研究所，安徽 合肥 230041）

明代李时珍著《本草纲目》 中记述有羊肚菌（Morchella） 子实体入药，其性平、味甘寒、无毒，有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾、补脑、提神等功效[1-3]。现代医学研究表明，羊肚菌有 “四抗”“两降”“一调节” 的药用功效。即有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗辐射的作用，降血压、降血脂功能和调节免疫力的功效[4-7]。同时，还发现羊肚菌含有锌、硒、VB1、VB2等多种矿物质和微量元素，以及19 种氨基酸，其中包括8 种人体必需氨基酸，其多糖和蛋白质含量也都超过20%[8-11]，因其营养价值较高而备受人们欢迎。此外，由于含有特殊的风味氨基酸，使得羊肚菌美味可口，成为一种名贵、高端的食用菌，在美食界被誉为“厨房珍宝”，深受世界各国消费者青睐。

因此，中外各国食用菌专家投入了大量的时间和精力对羊肚菌的人工栽培进行探索和研究。1883年，法国人ROZZ[12]在室外培育出羊肚菌子实体，但是栽培可重复性差。20 世纪80 年代，美国旧金山州立大学OWER 博士[13]利用业余时间在人工气候室成功培育出子实体并公开报道了具有可重复性的羊肚菌室内栽培技术，并申请了专利，这是世界上最早的室内人工栽培专利。我国从上世纪80 年代开始研究羊肚菌人工栽培技术，直到1994 年四川省绵阳市食用菌研究所朱斗锡[14]宣布室外人工栽培羊肚菌成功并获得国家专利，但产量不稳定。2003 年四川省林业科学研究院科研人员在栽培中采用外营养添加技术在花钵中培育出了1 朵完整的子实体，这是羊肚菌人工栽培一个划时代的转折点，后经不断验证和完善，到今天形成了较成熟的栽培技术[15]。

目前生产中使用的羊肚菌品种多而杂，菌种退化现象严重，多数品种不能适应当地气候，因此选育适应当地气候环境的羊肚菌新品种具有十分重要的意义。为选育出适合人工大面积栽培、品质好、产量高且稳定的新品种，开展此次试验。

1 试验方法

1.1 概况

野生羊肚菌样品于2013 年春季采自灵璧县的湖光村。采集时选取成熟饱满的子实体，连同菇脚完整采摘，用小纸袋单独包装，编号为WY1。

经鉴定后，于2013 年至2020 年进行了人工驯化。

1.2 分子生物学鉴定

采用CTAB 法提取样品基因组，用高保真酶PCR 扩增其ITS、LSU、EF1-α 片段序列，引物序列见表1。

表1 PCR 引物Tab.1 PCR Primers

扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 °C 变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR 产物送公司测序，测序结果用NCBI 数据库进行比对分析。

基于BLAST 结果从GenBank 中检索相关菌株的ITS、LSU、EF1-α 序列用MAFFT 7 进行比较，并用BioEdit 手动去掉两端不齐序列。利用PhyloSuite 软件对序列进行贝叶斯建树分析，然后在FigTree v.1.4.2软件中生成树图。

1.3 品种选育流程

羊肚菌选育流程见图1。

图1 羊肚菌育种流程图Fig.1 Flow chat of Morchella breeding

1.3.1 获得纯化菌株

1） 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、VB120 mg、琼脂15 g，水1 000 mL，pH 自然。

2） 制培养皿平板和斜面试管。将马铃薯切成丁加水1 000 mL，煮沸20 min，停止加热，待降温至约40 ℃，用4 层纱布过滤马铃薯汁到2 000 mL烧杯中，按配方称量试剂加入烧杯中，搅匀，补水到1 000 mL。准备500 mL 三角瓶及试管，每个三角瓶倒入150 mL 混合液，用分量器将混合液注入试管，每支注入10 mL。将注入混合液的三角瓶和试管以及用报纸卷好的培养皿（9.0 cm × 1.8 cm） 同时置于121 ℃、0.15 MPa 条件下高压灭菌20 min。待冷却到50～60 ℃时，取出三角瓶和平板放入超净工作台。放入前，超净工作台需打开紫光灯消毒灭菌30 min，关掉紫外灯后再放入三角瓶等。穿好工作服，用75%酒精消毒双手，在工作台内趁热将三角瓶中的培养基倒入培养皿，每皿约倒入10 mL，水平晃动一下使培养基分布均匀，冷却备用。趁热将斜面试管放入无菌室，冷却后备用。

3） 组织分离。将采集的野生羊肚菌子实体带回实验室阴干后，进行组织分离培养。进行组织分离前，无菌室和超净工作台需用紫光灯灭菌30 min，穿好工作服，进入实验室，75%酒精消毒双手，使用酒精灯对工具进行消毒。将子实体菇脚剪去，用75%酒精棉球擦拭菌柄和菌盖，然后用无菌水清洗5次。再用剪刀剪开子实体，用手术刀小心切取菌柄和菌盖交汇处组织，放于培养皿中央。

4） 上一步骤中萌发旺盛、无污染的菌丝，切取尖部5 mm 置于培养皿继续纯化。

5） 上一步骤中纯化后生长旺盛、粗壮的菌丝，切取尖部5 mm 置于斜面试管中，使其贴于试管培养基中部的正对面。在20 ℃的恒温培养箱中培养，7 d 后菌丝长满试管，获得纯菌株。

1.3.2 出菇试验

将获得的纯化菌株制成原种和栽培种，2013 年11 月10 日开始进行出菇试验，试验地点为岳西县温泉镇斯桥村。

1.3.3 品种适应性验证试验

样品采集自灵璧县湖光村，为验证适应性，需进行异地栽培试验。试验于2015 年11 月15 日开始，试验点选在皖南泾县桃花潭村。共设置4 个大棚进行棚栽，栽培面积约667 m2。

1） 拌料灭菌：原种培养基配方为小麦65%，干净的麦麸5%，麦秆（粉碎后长度为1～2 cm） 15%，干净的稻壳10%，生石灰1%，石膏1%，干净土壤3%。将麦秆、稻壳、麦麸和1%的生石灰加水拌匀（含水量约55%），用塑料膜盖严，建堆发酵24 h后，翻堆再发酵48 h 备用。建堆发酵的同时，将小麦用1%的生石灰水浸泡，充分膨胀后与备用的发酵料混合均匀，含水量为55%，及时装瓶灭菌。常压灭菌在排尽冷空气后保持48 h。灭菌后冷却至30 ℃时，将料袋运至接种室。

2） 原种制作：接种前将接种室和接种箱充分灭菌，在接种箱内将 “皖羊肚菌1 号” 试管母种接于灭菌后的栽培瓶中，一支试管接5 瓶原种。将接种好的原种瓶置于发菌室内发菌，发菌室避光、通风，温度20 ℃，相对湿度40%，约27 d 菌丝满瓶。

3） 栽培种制作：栽培种的配方、灭菌与制原种配方、灭菌相同，但为袋装。接种时，夹取约10 g原种接于袋中，接种后置于发菌室养菌，发菌室避光、通风、温度20 ℃、湿度40。约26 d 菌丝满袋。

4） 整地、搭棚、播种：2015 年10 月21 日（需选择晴天），在收割完的稻田（1 330 m2） 里，用旋耕机将稻田旋耕2 遍，均匀撒生石灰80 kg，再旋耕1 遍，利用阳光暴晒土壤杀菌。在无雨时搭好棚架，盖好塑料膜，将6 m 宽的大棚挖3 条沟，沟宽为35 cm，深15 cm，形成4 块地。由于稻田形状不规整，搭了4 个棚，每个棚内实际面积858 m2。11月15 日，地温18 ℃（地温降到20 ℃以下适宜栽培），盖好遮阳网（遮阳率80%），提前将栽培种放入消过毒的桶内轻轻揉散。棚内每块地开4 条深约3 cm 的浅沟，将菌种撒在沟内，盖上土，播种量为262～300 g·m-2。播完后洒水至土壤湿透，经过3 d菌丝长出地面。若地面干燥及时补水。

5） 放置营养袋：营养袋配方为小麦65%、麦麸5%、麦秆15%、稻壳10%、生石灰2%、石膏1%、干净土壤2%。营养袋使用聚乙烯袋（15 cm×34 cm×0.06 mm），其他制作方法与原种相同。11 月27 日，菌丝长满地面，在营养袋上顺袋划3 条口，划口间隔1 cm，放置时使划口正对地面菌丝。每667 平方米均匀放置1 800 个营养袋。11 月28 日将打好孔的黑色地膜盖上，在地膜两边每隔1 m 用土轻压。

1.3.4 品种比较试验

2017 年11 月12 日将 “皖羊肚菌1 号” 与引进的品种进行比较试验，引进的品种分别是四川省绵阳市食用菌研究所 “七妹09”，四川省农业科学院“川羊肚菌1 号”，本地品种CK。试验地点为岳西县温泉镇斯桥村，每个品种3 个重复，每个重复栽培面积为667 m2。

1.3.5 区域试验

2018 年11 月9 日，以四川引进品种七妹09 为对照（CK），对选育出的优良菌种“皖羊肚菌1 号” 开展了多点区域试验，每个点3 个重复，共栽培667 m2。

1.3.6 生产试验

2019 年11 月15 日在试验品种适宜栽培地区布点开展生产试验，每个点设置3 个重复，每个重复栽培面积为667 m2。栽培管理阶段营养袋增至3 袋/m2。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

野生羊肚菌样品采集情况见图2。

图2 灵璧县野生羊肚菌子实体Fig.2 Wild fruit body of Morchella in Lingbi County

如图2 所示，样本子实体生长于海拔25.8 m、向阳、潮湿的沙壤土中，菌脚周围有青苔，外围有阔叶杂树。

对样品进行ITS、LSU、EF1-α 序列比对，以3个序列串联构建进化树，结果见图3。

图3 样品WY1 分子生物学鉴定结果Fig.3 Molecular biological identification result of sample WY1

如图3 所示，WY1 与六妹羊肚菌（Morchella sextelata） 和七妹羊肚菌（Morchella eximia） 在一个分支上，但与此二者的序列相似度仅为94.7%，存在较大差异。因此，将皖羊肚菌1 号WY1 鉴定为新种。

2.2 纯化菌株获得情况

将样品组织分离，纯化培养，结果见图4。

图4 样品WY1 组织分离Fig.4 Tissue separation of sample WY1

如图4 所示，菌丝长满试管，获得纯化菌株。该菌株即为试管母种，可用于进行后续试验。

2.3 出菇试验结果

栽培面积为120 m2，2014 年春出菇见图5。

图5 样品WY1 出菇情况Fig.5 Fruiting situation of sample WY1

如图5 所示，试验地出菇情况良好，鲜菇产量为38.4 kg。将样品WY1 确定为目标菌株，并命名为“皖羊肚菌1 号”。

该菌株在显微镜下放大40 倍的情况见图6。

图6 “皖羊肚菌1 号” 菌丝显微图Fig.6 Hyphae micrograph of wan‘wan yangdujun1’

如图6 所示，该菌株在显微镜下观察呈现网状结构，有分叉且有明显的菌核形成。使用2013 年春在灵璧采集的野生羊肚菌继续制作试管母种，低温保存到下半年制作栽培种。

“皖羊肚菌1 号” 是安徽本土野生羊肚菌分离、驯化出来的菌株，其菌丝浓密，生长速度快，成熟的子实体菌盖深褐色、圆锥形，表面有不规则棱和囊，中空。菌柄白色，底端略粗，中空。子实体单生、菌盖高、菌柄短，菌肉厚，产量高且稳定，生物学转化率为45%。生长期约112 d。“皖羊肚菌1号” 与样本WY1 菌株特征比较见表2。

表2 菌株特征比较Tab.2 Comparison of strain characteristics

由表2 可知，与样本WY1 相比，“皖羊肚菌1号” 菌丝长势、菌丝体耐温性、适宜pH、子实体颜色等具有相同的特征，但子实体的耐温性和发育的适宜温度有所差异。“皖羊肚菌1 号” 的菌盖大于样本，菌柄小于样本。

2.4 异地栽培试验结果

“皖羊肚菌1 号” 母种见图7，接种后完成发菌的原种瓶见图8。

图7 “皖羊肚菌1 号” 母种Fig.7 Stock culture of‘wan yangdujun1’

图8 “皖羊肚菌1 号” 原种Fig.8 Mother spawn of‘wan yangdujun1’

2.5 品种比较试验结果

“皖羊肚菌1 号” 品种比较试验性状调查结果见表3。

表3 “皖羊肚菌1 号” 品种比较试验性状调查Tab.3 Investigation of comparative test characters of‘wan yangdujun1’cultivar

由表3 可知，“皖羊肚菌1 号” 菌株菌丝浓密，生长速度快，成熟的子实体深褐色，菌柄中等，菌盖粗且高。与对照及其他参试菌株差异显著。4 个品种羊肚菌三潮产量比较情况见表4。

表4 “皖羊肚菌1 号” 品种比较试验产量Tab.4 Yield comparative test of ‘wan yangdujun1’ cultivar

由表4 可知，2018 年3 月 “皖羊肚菌1 号” 鲜菇产量为232.8 kg·667-1m-2，与其他3 个品种相比产量平均提高了10.5%。

2.6 区域试验结果

区域试验结果见表5。

表5 “皖羊肚菌1 号” 区域试验结果性状调查Tab.5 The character investigation of regional test result of‘wan yangdujun1’cultivar

由表5 可知，菌丝生长速度快，菌丝浓密。生长期均提前，菌盖高而粗壮。六妹09 （CK） 和 “皖羊肚菌1 号” 区域试验产量对比见表6。

表6 “皖羊肚菌1 号” 区域试验结果产量统计Tab.6 Yield statistics of regional test result of‘wan yangdujun1’cultivar

由表6 可知，“皖羊肚菌1 号” 的平均产量为232 kg·667-1m-2，比对照（CK） 产量平均提高10.9%，具有良好的丰产性和稳定性。

2.7 生产试验结果

“皖羊肚菌1 号” 生产试验结果见表7。

表7 “皖羊肚菌1 号” 生产试验性状调查Tab.7 Investigation of production test characters of‘wan yangdujun1’cultivar

由表7 可知 “皖羊肚菌1 号” 菌丝浓密，生长速度快，菌盖高而粗，生长期均提前，菌柄短而中粗。2020 年春采摘鲜菇，生产试验产量对比见表8。

表8 “皖羊肚菌1 号” 生产试验产量统计Tab.8 Statistical of production test yield of‘wan yangdujun1’ cultivar

由表8 生可知，“皖羊肚菌1 号” 生产试验平均产量237.3 kg·667-1m-2，比对照平均增产9.9%，符合新品种鉴定要求。

3 栽培区域选择及技术要点

3.1 栽培区域选择

“皖羊肚菌1 号” 适应性强，子实体耐温性5～22 ℃，适宜温度8～16 ℃。在安徽全境和气候相似地区均可栽培。

3.2 栽培技术要点

3.2.1 整地、搭棚

在10 月中下旬将地块旋耕好，每667 平方米均匀撒生石灰40～60 kg，再用旋耕机旋匀，阳光暴晒7～10 d。用6 m 宽的棚架搭好大棚，盖上塑料膜，两边安上卷轴。再盖上85%遮阳率的遮阳网。棚内整成4 块地。3 条沟，沟深15 cm，沟宽40 cm。大棚长度不宜超过40 m。

3.2.2 播种

准备好盆或桶，用75%酒精对其内壁消毒，无毒纸巾擦干，将栽培种去袋于桶（盆） 内轻柔，使麦粒散开。同时在每块地上均匀开4 条沟（深约3 cm），将麦粒菌种均匀撒在沟内，覆盖上土，整个大棚播完种后洒上水，土壤潮湿即可。大棚内安装2个温湿度计，离地面30 cm，一个放棚中间，一个放距棚门口5 m 处。

3.2.3 大棚管理

播种后不急于盖地膜，棚内温度在约20 ℃时，不能盖地膜，卷上两边膜并开门通风，每天观察地面湿度情况，适时补水。3 d 后菌丝长出地面，10～15 d 地面覆盖菌霜，此时放置营养袋，将营养袋顺袋方向划3 道口，3 道口须接触地面菌丝，每667平方米均匀放置1 800 个营养袋。当平均气温下降到10 ℃以下时，确保土壤湿润时盖上黑色地膜，地膜上均匀打洞，利于透气。营养袋放置约30 d 时浇1 次重水，待地面菌霜消失，气温回升时揭开地膜，注意地面变化，看到大量原基形成时，浇水催菇，喷灌或在沟里灌满水使其漫过厢面，然后退去水，静等出菇。出菇期间，每天开棚通风，保持棚内湿度为80%～95%。

3.2.4 病虫害防治

按照 “预防为主，综合防治” 的方针，坚持“农业防治、物理防治、生物防治为主，化学防治为辅” 的治理原则，对羊肚菌病、虫、杂菌采取综合防治措施，确保羊肚菌品质安全优质。物理防治主要是当地面出现绿霉、白霉等杂菌时人工去掉或撒上生石灰。防治菇蚊等虫害可于夜间在灯光下放盆，盆里放糖水或羊肚菌浸出液，在盆中滴几滴敌敌畏（DDVP）。在大棚周围撒一圈生石灰。

3.2.5 采收、储藏

待羊肚菌长到8 成熟（即菌囊张开，菌顶未转成焦黑色之前） 及时采收，采收时菇脚不能带泥，按大小分级。天晴时可阳光晒干，天阴时要及时烘干。干羊肚菌分级用食品袋装好，放在阴凉干燥处待售。采第1 潮菇后，在厢面洒1 次水，刺激第2 潮出菇。

4 结论与展望

通过对安徽省灵璧县湖光村采集的野生羊肚菌资源进行分离、驯化、筛选，获得优良菌株并在本地进行出菇试验，株型和产量均达到育种目标。之后又经多年品种比较试验、区域试验、生产试验，“皖羊肚菌1 号” 均表现突出，且产量稳定，可在不同地区栽培、推广，可大大降低菇农生产风险。