云南黑松露醇提物对小鼠T淋巴细胞免疫调节作用

苏银芳,徐梓涵,袁雨欣,李干鹏,祁艳艳,王芳,蔡正达

(1.云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室,昆明 650500;2.云南省科学技术院,昆明 650500)

免疫是人体维持健康的重要生理机能。免疫力低下时,机体对外来入侵物质识别及防御能力降低,可引发多种疾病。因此,借助增强机体免疫能力控制疾病发生、发展一直是医学研究的关注点[1]。免疫系统功能主要涉及免疫防御、免疫监视、免疫自稳三个方面,三者对机体的整体免疫功能十分重要[2]。T淋巴细胞来源于骨髓多能干细胞,分布于外周免疫器官的胸腺依赖区,发挥细胞免疫及免疫调节等功能。功能性T细胞中辅助性T细胞包括Th1和Th2细胞,Th1细胞代谢产生的相关细胞因子主要有白细胞介素2(IL-2)、IL-12以及γ干扰素(IFN-γ),而这些细胞因子在介导细胞免疫应答反应中起关键作用[3]。天然产物中多糖成分具有机体免疫调节作用,多糖及多糖肽可以通过激活T细胞和B细胞,促使其增殖及提高对不同免疫细胞的分泌,因此受到免疫药理学研究者关注[4]。

松露学名黑孢块菌(Tuber melanosporum),属真菌门子囊菌纲块菌目块菌属食用真菌[5]。云南黑松露常被称为“猪拱菌”,是一种可以药食两用十分稀有珍贵的野生食用菌,但目前其调节免疫作用的研究笔者较少见到报道。笔者在本研究通过小鼠脾淋巴细胞炎症模型,观察云南黑松露醇提物对小鼠T细胞免疫的调节活性,以期为进一步研究其免疫调节作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 BALB/c纯系小鼠,雌性,6～7周龄,体质量18～22 g,购自北京华阜康实验动物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0008,饲养于云南民族大学民族医药学院清洁级动物房,保持光照、黑暗各12 h恒定循环,自由活动、进食、饮水。环境温度25 ℃,相对湿度40%～60%。实验操作符合《国家实验动物健康与管理条例》要求。

1.2药品与试剂 云南黑松露购自云南省昆明市中药材市场,经云南民族大学民族医药学院孙静贤副教授鉴定为黑松露(Tuber melanosporum)。细胞实验所用RPMI-1640培养基及胎牛血清(FBS)均购自BI公司(批号分别为2210060,2144324);无菌红细胞裂解液购自天根生化科技(北京)有限公司(批号:20160418);IFN-γ与IL-2酶联免疫试剂盒均购自美国Invitrogen公司(批号分别为219145-008,222653-005);IFN-γ蛋白抗体购自美国Affinity公司(批号:11p5029);聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro-phoresis,SDS-PAGE)凝胶快速配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号:051722220526);化学发光底物(enhanced chemiluminescence,ECL)显色试剂盒购自上海爱必信生物科技有限公司(批号:ZN18A01);Mouse TH1/TH2 Staining Kit 购自杭州联科生物技术股份有限公司(批号:A11015);色谱级甲醇购自美国Fisher scientific公司;娃哈哈纯净水;氘代-甲醇(批号:1455-13-6)、氘代三氯甲烷(批号:865-49-6)、氘代-二甲亚砜(DMSO,批号:2206-27-1)等试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.3仪器与设备 Shimadzushim-pack GIS-C18型反相半制备柱(250 mm×10 mm,5 μm,日本岛津公司);Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱(美国安捷伦仪器分析有限责任公司);EYELA旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社);ZF-7暗箱式三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司);Multiskan Go多功能酶标仪(美国Thermo);二氧化碳培养箱(美国Thermo-fisher);5417R高速离心机(Eppendorf);SDS-凝胶电泳体系(美国Bio-RAD公司);CytoFLEX LX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.4云南黑松露的提取分离 取云南黑松露30 g,分别用75%和95%乙醇热浸超声提取7 次(42 ℃),每次8 h,每次用量12 L,合并提取液滤过、减压浓缩后各得浸膏4和3.6 g,以乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部分和水相部分。取1 g两种比例乙醇提取物的水相部分浸膏分别经Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱进行梯度洗脱、分离。分离体系为:10%,30%,60%,80%甲醇-水溶液和100%甲醇,依据薄层色谱分析结果将相同成分段进行合并。取两种比例乙醇提取物的乙酸乙酯部分1 g经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱(100%甲醇)进行分离。

1.5实验试剂的制备 ①取云南黑松露样品100 mg,溶于DMSO 1 mL,配制成100 mg·mL-1母液。使用时,依据实验所需,以含10%FBS的RPMI-1640培养基稀释至目标浓度。②ConA的配制:取ConA 3 mg,溶解于RPMI-1640 培养基100 μL,配制成30 mg·mL-1母液,使用时以相应培养液稀释成0.3 μg·mL-1液体,滤过,分装备用。③Anti-CD3采用灭菌PBS 缓冲液配制成2 mg·mL-1母液,终浓度2 μg·mL-1。④噻唑蓝(MTT)溶液的配制:取MTT50 mg,溶解于PBS缓冲液10 mL,母液浓度5 mg·mL-1,滤过除菌后-20 ℃冰箱贮存备用。

1.6小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 取BALB/c雌性小鼠1或2 只,处死,75%乙醇浸泡后超净工作台取脾脏,置10%FBS的RPMI-1640培养基3 mL充分研磨,200目金属网过滤到EP 管,1200 r·min-1离心5 min(r=7.25 cm)。去上清液,加入红细胞裂解液1～2 mL混匀,室温静置2 min,再次过滤、离心,冰浴备用。

1.7MTT检测细胞增殖率 以含10% FBS的RPMI-1640培养液将小鼠脾淋巴细胞悬液调整为5×106个·mL-1,接种于96 孔板,每孔100 μL。设置阴性对照组、ConA 组和不同浓度云南黑松露分段样品组。阴性对照组加10%FBS的RPMI-1640培养基100 μL,ConA组加10%FBS的RPMI-1640培养基和ConA溶液各50 μL,不同浓度云南黑松露分段样品组加待测样品和ConA溶液各50 μL,每组设复孔3个。将加样后的96孔板置5%CO2、37 ℃培养箱培养48 h。48 h后每孔加入MTT溶液20 μL继续培养2 h,离心,弃去上清液,每孔加DMSO150 μL,震荡、溶解,570 nm波长处检测吸光度(A值),计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/阴性对照组A值×100%。

1.8ELISA法检测IL-2与IFN-γ 取24孔板,除阴性对照组外,每孔加入Anti-CD3试剂300 μL,置CO2培养箱培养4 h,吸去Anti-CD3试剂;阴性对照组与Anti-CD3组加入10% FBS的RPMI-1640 培养基500 μL,样品处理组加入待测样品500 μL。将小鼠脾淋巴细胞悬液浓度调整为2×106个·mL-1,每孔加入脾淋巴细胞悬液500 μL。每组设复孔3个。继续培养24 h后,收集培养上清液,依据ELISA检测试剂盒说明书进行IL-2与IFN-γ细胞因子含量测定。

1.9Western blotting法测定小鼠脾淋巴细胞IFN-γ蛋白表达量 重复“1.8”项操作,收集细胞,裂解蛋白。用10%SDS分离胶体系进行蛋白电泳,湿法转膜,室温封闭2 h,在相应条带分别加入IFN-γ及β-actin一抗(1：1000),4 ℃摇床孵育过夜。PBS/T洗3次,每次5 min,加相应二抗(1：4000 ),室温孵育2 h。PBS/T洗3次,每次5 min,加ECL显影。图像经Image J软件测定灰度值,依据内参β-actin灰度值标准化分析IFN-γ,得到各待测蛋白样品IFN-γ相对表达值。

1.10流式细胞术检测CD3、CD4淋巴细胞 重复“1.8”项操作,培养24 h,收集细胞悬液至流式管,加入PMA /Ionomycin /BFA /Monensin Mixture(250x)1 μL。以只含细胞悬液的样本为对照。混匀,37 ℃孵育4～6 h,每隔1～2 h取出震荡混匀。从样本管和对照管中取细胞悬液100 μL至新流式管,加入5 μL鼠抗CD3抗体,FITC和5 μL鼠抗CD4抗体,PerCP-Cy5.5。震荡混匀,室温避光孵育15 min。每管加入FIX &PERM MediumA 100 μL,震荡混匀,室温避光孵育15 min。每管加入预冷1×流式染色缓冲液2 mL,1 200 r·min-1离心5 min(r=7.25 cm),弃去上清液。每管加入FIX &PERM Medium B100 μL、Anti-Mouse IFN-γ和PE5 μL,Anti-Mouse IL-4 5 μL,APC。震荡混匀,室温避光孵育15 min。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 2 mL,1200 r·min-1离心5 min(r=7.25 cm),弃去上清液。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 500 μL重悬,上机检测;或者加入1%～4 %多聚甲醛500 μL重悬,2～8 ℃避光,24 h检测。

2 结果

2.1云南黑松露醇提物样品组分分离提取结果 按“1.4 ”项方法,提取得到云南黑松露醇提物水相部分和乙酸乙酯部分。水相部分经过Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱分离得到样品8个,记作1-8号组分;乙酸乙酯部分经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱分离得到样品9个,记作A-I号组分。

2.2云南黑松露醇提物对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响 对上述分离获得的17个组分进行小鼠脾淋巴细胞增殖活性影响检测。结果显示1号组分、2号组分、F号组分和G号组分在浓度为0.8～20 μg·mL-1范围内对该细胞具有促进增殖作用,结果见图1。

A.云南黑松露醇提物水相部分;B.云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分。图1 云南黑松露醇提物对ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 A.Aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle;B.Ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle.Fig.1 Effect of alcohol extract of Yunnan black truffle on ConA-induced proliferation of mouse spleen lymphocytes

2.31、2、F和G号组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 结果见表1与表2。结果显示,1号组分在20 μg·mL-1时促增殖作用最佳[增殖率(86.11±3.12)%],2号组分在40 μg·mL-1下呈现出与1号组分相当的促增殖作用[增殖率(86.27±7.45)%];F和G号组分在0.8和4 μg·mL-1均呈现出一定促增殖作用,其中F号组分在0.8 μg·mL-1即呈现出较好促增殖活性,增殖率(88.81±0.49)%,差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 云南黑松露醇提物水相部分对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响Tab.1 Effect of aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

表2 云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响Tab.2 Effect of ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

2.41、2、F和G号组分对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2的影响 采用ELISA 法检测系列浓度1、2、F和G号组分对脾淋巴细胞培养上清液中IL-2与IFN-γ 细胞因子的影响。结果见图2-3。在Anti-CD3刺激下,1号组分在80 μg·mL-1时对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2促进作用显著高于Anti-CD3组,差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ浓度并未表现出明显差异;2号组分则对这两个细胞因子均未显示出促进作用。

①与Anti-CD3 组比较,t=3.887,P<0.05。图2 1号组分对小鼠脾淋巴细胞细胞因子的影响 ①Compared with Anti-CD3 group,t=3.887,P<0.05.Fig.2 Effects of Component 1 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

图3 2号组分对小鼠脾淋巴细胞细胞因子的影响Fig.3 Effects of Component 2 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,F号组分在0.625～2.5 μg·mL-1浓度范围内促进小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ作用显著高于Anti-CD3刺激组,且呈现较好的浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.01),但对IL-2 分泌无明显促进作用(图4)。

①与Anti-CD3组比较,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01。图4 F号组分对小鼠脾淋巴细胞细胞因子的影响 ①Compared with Anti-CD3 group,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01.Fig.4 Effects of component F on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,G号组分对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2作用未见明显差异,而与Anti-CD3组相比,G号组分可显著促进IFN-γ分泌,差异有统计学意义(P<0.05)。随着G号组分浓度增高,其对IFN-γ的作用有所降低(图5)。

①与Anti-CD3组比较,t=4.012,P<0.05。图5 G号组分对小鼠脾淋巴细胞细胞因子的影响 ①Compared with Anti-CD3 group,t=4.012,P<0.05.Fig.5 Effects of component G on cytokines in mouse spleen lymphocytes

2.51、2、F和G号组分对小鼠脾淋巴细胞IFN-γ 表达水平的影响 依据 “2.3”和“2.4”项实验结果,将黑松露醇提物1、2、F和G号组分进行Western blotting 实验,探讨其对IFN-γ 蛋白表达是否有影响。如蛋白表达水平检测结果所示:与Anti-CD3组相比,1号组分在20～80 μg·mL-1时对IFN-γ蛋白表达水平影响有一定趋势,浓度为80 μg·mL-1时差异有统计学意义(P<0.01);2号组分在在20～80 μg·mL-1时显著提高IFN-γ蛋白表达水平,并且具有较好的浓度依赖性(P<0.05或P<0.01);F号组分在0.625 ～2.5 μg·mL-1范围内提高IFN-γ蛋白表达量,与Anti-CD3组相比,在2.5 μg·mL-1浓度下达到最大值(P<0.01);G号组分也与F号组分有类似趋势,与Anti-CD3组相比,G号组分在1.25～2.5 μg·mL-1浓度显著提高IFN-γ 蛋白表达量(P<0.01)。见图6。

①与Anti-CD3组比较,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②与Anti-CD3组比较,t=3.319,P<0.05。图6 4种组分对小鼠脾淋巴细胞IFN-γ蛋白表达水平的影响①Compared with Anti-CD3 group,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②Compared with Anti-CD3 group,t=3.319,P<0.05.Fig.6 Effects of four components on IFN-γ expression in mouse spleen

①与Anti-CD3组比较,t=11.34,P<0.05(n=5)。图7 5组小鼠脾淋巴细胞中表达情况①Compared with Anti-CD3 group,t=11.34,P<0.05(n=5).Fig.7

①与Anti-CD3组比较,t=17.36,10.23,P<0.01。图8 5组小鼠脾淋巴细胞中表达情况①Compared with Anti-CD3 group,t=17.36,10.23,P<0.01.Fig.8

2.81、2、F和G号组分对小鼠脾淋巴细胞Th1/Th2细胞比例的影响 结果见图9。1 号组分组Th1细胞比例高于Anti-CD3组,差异有统计学意义(P<0.05)。2、G和F号组分组Th1细胞比例差异无统计学意义。1号组分组Th2细胞比例低于Anti-CD3组,G号组分组Th2 细胞比例高于Anti-CD3组,差异有统计学意义(P<0.05)。2、F号组分组与Anti-CD3组比较,差异无统计学意义。

①与Anti-CD3比较,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05。图9 5组小鼠脾淋巴细胞Th1 /Th2细胞表达情况①Compared with Anti-CD3 group,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05.Fig.9 Expression of Th1 /Th2 cells in mouse spleen

3 讨论

本实验中,从云南黑松露提取分离得到17个组分,建立BALB/c小鼠脾淋巴细胞增殖模型以0.8～100 μg·mL-1浓度梯度进行活性筛选,1、2、F和G号4个组分在不同浓度下可促进脾淋巴细胞增殖,具有协同增强ConA对小鼠T淋巴细胞增殖的作用。研究表明,乙酸乙酯部分萃取样品大多富含萜类化合物,而单萜烯可增强BALB/c小鼠的脾细胞增殖[12],与本研究结果相似。T细胞增殖作用对CTL、NK以及巨噬细胞增殖活化都具有一定促进作用,从而使机体分泌出更多IL-2、IFN-γ 等细胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干扰素,同时也被称为免疫干扰素,是一类具有较好抗病毒效果的生物活性物质,在免疫调节方面具有关键作用,并且还能促进各种免疫细胞因子的表达,从而达到提高机体分泌相关抗体的作用。本研究中,笔者通过ELISA 法检测IFN-γ和IL-2水平,探讨云南黑松露醇提物中1、2、F和G号组分对细胞因子的影响。结果显示4 个组分在不同浓度下可促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2浓度,而IFN-γ和IL-2高分泌表达可以促进Th1细胞活化,在营养学抗癌免疫前沿中具有重要作用。笔者采用Western blotting实验,继续探讨这4个组分对IFN-γ蛋白表达的影响,结果显示2、F和G号组分在相应浓度下可促进IFN-γ蛋白表达,进一步验证了云南黑松露醇提物对Th1免疫反应的促进作用以及提高免疫调节活性作用[13]。