miRNA-181a、胱天蛋白酶富集域家族成员11、核因子κB在弥漫大B 细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义△

陈青，郭广秀，王建

赣州市人民医院病理科，江西 赣州 341000

弥漫大B 细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，在生物学、遗传学、形态学等方面均具有高度异质性[1-2]。临床多采用利妥昔单抗联合环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松（CHOP）方案治疗弥漫大B 细胞淋巴瘤，60%～70%的患者可治愈，但仍有部分患者对治疗的反应较差，且易复发或进展[3-4]。研究表明，弥漫大B 细胞淋巴瘤的发病与体内微小RNA（microRNA，miRNA）的表达密切相关，miRNA-181a 可抑制细胞分化过程中关键基因的表达，从而抑制B 淋巴细胞恶性转化，可能参与弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展[5-6]。胱天蛋白酶富集域家族成员11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）可介导获得性免疫反应，增强核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表达，诱发细胞凋亡、信号转导等，对弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展具有一定的促进作用[7-8]。有关研究已证实CARD11 在弥漫大B 细胞淋巴瘤淋巴结组织中表达，且是患者远期生存的独立影响因素[9]。明确miRNA-181a、CARD11 与弥漫大B 细胞淋巴瘤病情进展的关系对及时采取针对性干预治疗至关重要，基于此，本研究探讨miRNA-181a、CARD11、NF-κB在弥漫大B 细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014 年7 月至2020 年6 月于赣州市人民医院就诊的弥漫大B 细胞淋巴瘤患者。纳入标准：①经影像学和病理学检查首次确诊为弥漫大B 细胞淋巴瘤；②可耐受利妥昔单抗联合CHOP 治疗方案，一线治疗至少接受6 个周期的标准治疗方案；③年龄为25～73 岁；④临床资料完整。排除标准：①惰性淋巴瘤转化为弥漫大B 细胞淋巴瘤；②合并其他恶性肿瘤；③合并严重肝、肾功能异常。依据纳入和排除标准，本研究纳入85 例弥漫大B 细胞淋巴瘤患者作为观察组，男48 例，女37 例；年龄25～73 岁，平均（64.56±8.01）岁。另选取同期赣州市人民医院收治的60 例增生性淋巴结炎患者作为对照组，男35 例，女25 例；年龄28～69 岁，平均（65.03±7.86）岁。两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）检测miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量

采集两组患者治疗前的淋巴结组织，切开并应用10%福尔马林固定，常规脱水及切片，应用总RNA提取试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书逆转录合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），应用PCR 仪进行PCR 扩增。PCR 条件：95 ℃5min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，共50 个循环；95 ℃10 s，60 ℃10 s，40 ℃30 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，采用2-ΔΔCt法检测miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相对表达量。GAPDH上游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3'，下游引物5'-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG-3'；miRNA-181a 上游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC3'，下游引物5'- ACACTCCAGCTTCACCATTCAACGCTGTCG-3'；CARD11上游引物5'-CAGAGGAGCTGCGAGACAA-3'，下游引物5'-GGTGCTTGTACATTTCACAGTCC-3'；NF-κB上游引物5'-GGCGTGTATAAGGGGCTATAA-3'，下游引物5'-TTTTCCCGATCTCCCAGCTC-3'。

1.3 资料收集

收集弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的临床资料，包括性别、年龄、淋巴瘤结外累及数目、临床分期、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分[10]。临床分期按照Ann Arbor-Cotswolds 分期标准[11]进行评估。

1.4 疗效评价标准

根据实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）[12]评价两组患者的临床疗效。完全缓解（complete response，CR）：肿瘤病灶完全消失，至少持续1 个月；部分缓解（partial response，PR）：肿瘤病灶长径总和与基线相比减少≥30%，至少持续1 个月；疾病稳定（stable disease，SD）：肿瘤病灶长径总和与基线相比减少＜30%或增加＜20%；疾病进展（progressive disease，PD）：肿瘤病灶长径总和与基线相比增加≥20%或出现新病灶。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差（±s）表示，3 组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）分析miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测对弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的诊断价值及对疗效的预测价值；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较

不同性别、年龄、血清LDH 水平、结外累及数目弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；Ann Arbor 分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI 评分为3～5 分弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相对表达量分别明显高于Ann Arbor 分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI 评分为0～2分的患者，差异均有统计学意义（t=6.644、3.343，P＜0.01）。不同性别、年龄、血清LDH 水平弥漫大B 细胞淋巴瘤患者CARD11mRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；结外累及数目＞1 个、Ann Arbor 分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI 评分为3～5 分弥漫大B 细胞淋巴瘤患者CARD11mRNA相对表达量分别明显高于结外累及数目≤1 个、Ann Arbor 分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI 评分为0～2 分的患者，差异均有统计学意义（t=3.064、8.461、7.537，P＜0.01）。不同性别、年龄、血清LDH 水平弥漫大B 细胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；结外累及数目＞1 个、Ann Arbor 分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI 评分为3～5 分弥漫大B 细胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相对表达量分别明显高于结外累及数目≤1 个、Ann Arbor 分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI 评分为0～2 分的患者，差异均有统计学意义（t=3.057、11.967、2.394，P＜0.01）。（表1）

表1 不同临床特征弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较

2.2 观察组和对照组患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较

Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均高于对照组，Ⅲ～Ⅳ期弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相对表达量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 观察组和对照组患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较（±s）

表2 观察组和对照组患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与Ⅰ～Ⅱ期比较，P＜0.05

组别观察组Ⅰ～Ⅱ期（n=41）Ⅲ～Ⅳ期（n=44）对照组（n=60）F值P值miRNA-181a CARD11 mRNA NF-κB mRNA 1.21±0.24a 1.62±0.32ab 0.56±0.11 284.308＜0.01 0.92±0.13a 1.21±0.18ab 0.48±0.07 422.493＜0.01 1.25±0.21a 1.86±0.26ab 0.66±0.11 484.608＜0.01

2.3 不同疗效弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相对表达量的比较

疗效为CR/PR/SD 弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均低于疗效为PD 的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同疗效弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量的比较（±s）

表3 不同疗效弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量的比较（±s）

疗效CR/PR/SD（n=65）PD（n=20）t值P值miRNA-181a 1.34±0.21 1.68±0.26 5.978＜0.01 CARD11 mRNA 1.04±0.19 1.17±0.20 2.643＜0.05 NF-κB mRNA 1.49±0.28 1.84±0.26 4.967＜0.01

2.4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 单独及联合检测对弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的诊断价值

ROC 曲线显示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测诊断弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的AUC为0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独检测的0.852、0.841、0.830。（表4、图1）

图1 miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测诊断弥漫大B细胞淋巴瘤患者临床分期的ROC曲线

表4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 单独及联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者临床分期的诊断价值

2.5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 单独及联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者疗效的预测价值

ROC 曲线显示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测预测弥漫大B 细胞淋巴瘤患者疗效的AUC 为0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独检测的0.847、0.684、0.816。（表5、图2）

图2 miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测预测弥漫大B细胞淋巴瘤患者疗效的ROC曲线

表5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 单独及联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者疗效的预测价值

3 讨论

弥漫大B 细胞淋巴瘤的异质性较强，标准治疗具有较好的治疗效果，然而其治疗方式单一，仍有许多患者治疗失败，导致预后较差，随着病情进展可累及组织或器官，导致肿瘤浸润、肿块压迫及出血等[13-14]。临床上常采用IPI 评分评估弥漫大B 细胞淋巴瘤病情危险程度，然而其评估价值具有一定的局限性[15]。因此，预测肿瘤的发展情况并及时给予相应的治疗，对于提高患者生存率具有重要意义。既往研究显示，miRNA 可通过调节细胞分化、增殖、凋亡等过程参与肿瘤的发生发展，miRNA-181a 是T 淋巴细胞的敏感性和选择性调节器[16]。CARD11 与肿瘤进展和细胞侵袭密切相关，主要通过NF-κB 影响细胞凋亡、信号转导等[17-18]，但关于二者与弥漫大B 细胞淋巴瘤病情进展的关系尚未见报道。

本研究比较对照组与观察组患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量，结果显示，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期观察组患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均高于对照组，且Ⅲ～Ⅳ期、IPI 评分为3～5 分弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均高于Ⅰ～Ⅱ期、IPI 评分为0～2 分的患者。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB参与弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展，且随着病情进展，其表达水平升高。这可能是因为，miRNA-181a 可通过调控下游靶基因的表达参与弥漫大B 细胞淋巴瘤的发生发展，还可通过抑制CARD11 的表达抑制肿瘤生长。CARD11 是一种支架蛋白，可介导获得性免疫反应，调节细胞膜和细胞骨架之间的相互作用。高表达的CARD11 可激活NF-κB 上游信号分子，导致NF-κB表达升高，抑制T 细胞增殖，从而诱导其凋亡。

本研究比较不同临床分期弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量，结果显示，Ⅲ～Ⅳ期弥漫大B 细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB表达水平与弥漫大B 细胞淋巴瘤患者病情进展有关，病情越严重，其表达水平越高。分析原因如下：miRNA-181a 在组织分化、细胞增殖和凋亡过程中扮演了重要角色，可通过调控多种抑癌基因和原癌基因的表达对肿瘤的发生发展过程进行调控[19]。CARD11 在T 和B 细胞诱导的NF-κB 活化过程中发挥了关键作用，可增强组成型NF-κB 的活性，促进NF-κB 活性相关抗原受体表达，从而参与弥漫大B 细胞淋巴瘤的发展过程[20]。NF-κB 是一种从B 细胞的细胞核中提取出来的可与免疫球蛋白κ链基因特异性结合的核蛋白因子，家族中每个成员N 末端均含有两种类似免疫球蛋白的结构域[21-22]；NF-κB 广泛存在于各种类型的细胞中，当机体受到疾病侵袭时，被激活的NF-κB 参与多种细胞因子（如黏附因子、转录因子、细胞因子等）对刺激的反应，从而促进肿瘤细胞增殖、转移，还可促进肿瘤新生血管生成及耐药，当弥漫大B 细胞淋巴瘤患者疾病进展时，其表达水平随之升高，与相关研究报道的结果一致[23-24]。本研究结果还显示，疗效为CR/PR/SD弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相对表达量均低于疗效为PD 的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示通过监测弥漫大B 细胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 水平可对治疗效果进行判断，miRNA-181a、CARD11、NF-κB高表达可能反映患者预后较差。本研究采用ROC 曲线评估miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者临床分期的诊断价值，结果显示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测诊断弥漫大B 细胞淋巴瘤患者临床分期的AUC 为0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独检测的0.852、0.841、0.830。采用ROC 曲线评估miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独及联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤患者预后的预测价值，结果显示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测预测弥漫大B 细胞淋巴瘤患者疗效的AUC 为0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB单独检测的0.847、0.684、0.816。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤的诊断价值较高，对预后的预测价值较高。

综上所述，miRNA-181a、CARD11、NF-κB可作为弥漫大B 细胞淋巴瘤患者病情监测和预后预测指标，其表达水平升高提示患者病情可能加重，三者联合检测对弥漫大B 细胞淋巴瘤的诊断价值较高，且对预后的预测价值较高。