聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载

李桂芳, 康玲玲, 朱华泰, 赵静养, 雷建都, 宋先亮

(北京林业大学 林业生物质材料与能源教育部工程研究中心,北京 100083)

姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取出来的天然活性成分,具有抗肿瘤、抗菌、消炎、抗病毒、促进伤口愈合等多种药用功效[1-3]。但是,姜黄素有水溶性和稳定性差的缺点,为达到治疗效果需多次给药,临床应用受限[4]。将姜黄素包裹在微球[5]、纳米粒[6]、脂质体[7]中,可以提高其稳定性,增强生物利用度。磁性微球作为一种靶向给药技术引起了人们的关注,通过施加外磁场,药物缓释磁性微球集中于靶器官,可缓慢释药,降低毒副作用[8]。金鑫等[9]采用乳化-溶剂挥发法制备了地塞米松聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)磁性微球并对其形貌及体外释放性能进行表征,结果显示:该微球缓释时间长、磁响应较好、生物相容性良好,但是,该方法制备的微球粒径不均一。谌亮等[10]采用三相微流控技术制备了PLGA微球,其粒径分布较窄,球形圆整度极好,计算得到的离散系数(CV)为3.83%,分散性良好。任平伟等[11]采用膜乳化法和微流控法2种乳化技术制备出单分散水包油(W/O)乳液,乳液粒径的CV分别为10.60%和3.90%,均表现出良好的单分散性。但是,文献报道的工艺均需要特定的设备,制备过程复杂,难以实现规模化生产。本研究采用搅拌-均质两步乳化法制备姜黄素/PLGA磁性微球,即先在低速搅拌分散后、再用高速均质乳化,而后将溶剂挥发制得磁性微球。通过改变制备条件来优化微球形态、粒径分布及其载药量、包封率,得到姜黄素/PLGA磁性微球的较优工艺。

1 实 验

1.1 材料与仪器

聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)共聚物,重均相对分子质量(Mw)约44 000,济南岱罡生物工程有限公司;姜黄素(质量分数98%),百灵威科技有限公司;油酸(OA,质量分数90%),西格玛试剂;FeCl3·6H2O(质量分数99%)、FeCl2·4H2O(质量分数98%),上海麦克林生化科技有限公司;聚乙烯醇(PVA),Mw约27 000,罗恩试剂;磷酸盐缓冲溶液(PBS),0.01 mol/L,北京雷根生物技术有限公司。NH3·H2O、HClO4、二氯甲烷(DCM)、无水乙醇、无水甲醇,均为分析纯;所用水均为去离子水。

LW300-28CT光学显微镜;FSH-2A高速均质机,金坛区西城新瑞仪器厂;UV759CRT型紫外分光光度计,上海佑科有限公司;Mastersizer3000马尔文激光粒度仪,马尔文仪器公司;7404型振动样品磁强计,美国LakeShore公司;Riga Ku TG-DTA8122热重分析仪,日本理学公司。

1.2 姜黄素/PLGA磁性微球的制备

1.2.1Fe3O4@OA的合成 参考文献[12]的方法,将1.07 g(5.3 mmol)的FeCl2·4H2O和2.86 g(10.6 mmol)的FeCl3·6H2O按物质的量比1∶2加入30 mL水中,搅拌溶解,通氮除氧30 min,升温至60 ℃。在快速搅拌下加入NH3·H2O调pH值至9,当体系变为黑色后,滴加1.4 mL的油酸,恒温保持10 min,随后升温至90 ℃,继续搅拌反应30 min。然后降至室温,加入2 mol/L的HClO4调pH值至4,将黑色沉淀通过磁场分离进行洗涤,制备得到油酸改性Fe3O4(Fe3O4@OA)磁性纳米颗粒(粒径8 nm),保存在乙醇中备用。

1.2.2PLGA磁性微球负载姜黄素 称取适量PVA溶于PBS溶液(pH值为7.4)中,充分溶解后得到一定质量分数的PVA溶液,后续作为水相使用。称取一定量的PLGA、Fe3O4@OA、姜黄素溶于1 mL二氯甲烷/甲醇(体积比9∶1)混合溶剂中,作为油相。在160 r/min搅拌下将油相滴加到PVA溶液中,搅拌3 min,得到初乳液,而后迅速取出,再高速均质3 min,得到终乳液。将终乳液在600 r/min下搅拌2 h,挥发有机溶剂,得到固化微球。最后3 000 r/min离心,用去离子水洗涤,冷冻干燥得到姜黄素/PLGA磁性微球。在合成过程中不添加Fe3O4@OA纳米颗粒和姜黄素得到搅拌-均质PLGA空白微球,仅添加Fe3O4@OA制备PLGA磁性微球。

1.2.3直接均质法制备PLGA空白微球 称取一定量的PLGA溶于1 mL二氯甲烷/甲醇(体积比9∶1)混合溶剂中,作为油相。将油相直接滴入到一定体积的PVA溶液(水相)中,置于均质机高速均质分散,得到终乳液。将终乳液600 r/min搅拌2 h,挥发有机溶剂,得到固化微球。最后3 000 r/min离心,用去离子水洗涤,冷冻干燥得到均质PLGA空白微球。

1.3 微球载药性能

1.3.1姜黄素标准曲线的建立 精密称取姜黄素标准品10 mg,与10 mL甲醇配制成1.00 g/L的姜黄素甲醇溶液,然后分别稀释成质量浓度为0.05、 0.10、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、 1.00、 3.00 mg/L的系列标准溶液。利用紫外分光光度计测定不同质量浓度的姜黄素标准溶液在特定吸收波长处的吸光度(A),做3次实验,取平均值。通过全波长扫描法确定姜黄素的最大吸收波长在432 nm处,并对其标准溶液进行吸光度测定,得到质量浓度(C)与吸光度(A)的回归方程A=0.295 8C+0.008 5,R2=0.999 7(线性范围:0.05～3.00 mg/L)。

1.3.2微球载药率与包封率 精密称量姜黄素/PLGA磁性微球10 mg,加入二氯甲烷/无水甲醇(体积比为1∶24)混合溶液破乳溶解,外加磁场作用下静置沉淀,在波长432 nm处测定上清液的吸光度,根据标准曲线计算药物质量,根据式(1)、(2)计算包封率(EE)、载药率(DL):

EE=m1/m2×100%

(1)

DL=m1/m3×100%

(2)

式中:m1—包封的姜黄素质量,mg;m2—微球中姜黄素的总质量,mg;m3—姜黄素微球的总质量,mg。

1.3.3微球的体外释放 精确称量冻干后的载药磁性微球20 mg,溶于5 mL不同pH值的PBS缓冲液中,而后移入截留分子质量(MWCO)为3 500 u的透析袋中,浸泡在45 mL相应pH值的PBS缓冲液中,在摇床中恒温(37 ℃,150 r/min)振荡。定时取出上清液1 mL,并补充PBS缓冲液1 mL,在432 nm波长处测定上清液吸光度,按式(3)计算药物累积释放率(Q)。

Q=(Cn+Cn-1+Cn-2+…+C1)V/(m×DL)×100%

(3)

式中:Cn—各时间点测得的药物质量浓度,mg/L;V—释放介质的体积,mL;m—微球的质量,mg。

1.4 分析表征

1.4.1形貌分析 取1滴姜黄素/PLGA磁性微球溶液滴于载玻片上,通过光学显微镜观察其形貌,并通过Image J软件测量微球的粒径大小。

1.4.2磁感应强度 称取一定量的Fe3O4@OA和姜黄素/PLGA磁性微球,利用振动样品磁强计(VSM)对Fe3O4@OA和姜黄素/PLGA磁性微球进行磁性能分析。

1.4.3热重分析 控制热重分析条件为:氮气气氛,25～650 ℃,升温速度为10 ℃/min。热重分析检测后剩余的质量为微球中所含的Fe3O4的质量,按式(4)计算Fe3O4在Fe3O4@OA中的质量分数,从而得到Fe3O4@OA与姜黄素/PLGA磁性微球的质量比值,即可视为微球的含磁量。

ω=(1-m失/m总)×100%

(4)

式中:ω—Fe3O4占Fe3O4@OA的质量分数,%;m失—Fe3O4@OA纳米颗粒分解的质量,mg;m总—Fe3O4@OA纳米颗粒的质量,mg。

2 结果与讨论

2.1 姜黄素/PLGA磁性微球制备工艺探讨

2.1.1乳化方法的影响 乳化方法是影响微球均一性的重要因素,选择合适的乳化方法可以制备粒径均一的微球。采用直接均质法和搅拌-均质两步乳化法制备PLGA空白微球,通过二者的显微镜图对比,如图1所示,可以发现采用搅拌-均质两步乳化法制备的微球比较均一,平均粒径为(2.10±0.34)μm。这主要是因为第一步低速搅拌时获得了乳滴粒径较大且不均一的初乳液,然后再将初乳液高速均质时,大的乳滴更容易破碎变小,经溶剂挥发后便获得了粒径较均一的乳滴和微球。因此,后续实验采用搅拌-均质两步乳化法制球。

a.搅拌-均质stirring-homogenization; b.直接均质direct homogenization图1 不同乳化方法制备的PLGA空白微球的光学显微镜照片Fig.1 Optical microscopic photos of PLGA blank microspheres with different emulsification methods

2.1.2高速均质速度的影响 均质速度是影响微球粒径大小的直接因素,分别控制高速均质速度为9 000、 12 000、 15 000和18 000 r/min,研究其对微球粒径及分布的影响,结果见图2(a)。由图可知,随着均质速度的增加,微球的粒径逐渐减小。当高速均质速度为15 000和18 000 r/min时,微球均表现出较小的粒径和较好的均一性,粒径分别为(2.10±0.35)μm和(1.90±0.31)μm,出于安全及能耗的考虑,故选择15 000 r/min进行后续的实验。

a.高速均质速度 high speed homogenization speed; b.水油相体积比 volume ratio of water to oil phase; c.PLGA用量PLGA dosage;

2.1.3水油相体积比的影响 水油比是乳液稳定性和分散性的决定因素,水的比例越大,液滴之间的间距越大,不易发生吞并现象,且整个乳液体系的黏度降低,乳滴更容易被打散,从而获得粒径更小的乳滴。分别控制水油体积比为5∶1、 10∶1、 15∶1和20∶1,油相体积为1 mL,研究其对微球粒径大小及均一性的影响,结果见图2(b)。从图2(b)可以看出,水油比值为5时,微球粒径相对较大,随着水油比的增加,粒径较小的微球越来越多,当水油比值为10时,粒径(2.20±0.35)μm,粒径分布相对均一,故采用水油比10∶1进行后续实验。

2.1.4PLGA用量的影响 PLGA的用量决定了油相的黏度,油相黏度增加,对流减小,可以制备更加均一的微球。考察了60、 80、 100和120 mg的PLGA用量对微球粒径及均一性的影响,结果见图2(c)。随PLGA用量的增加,微球粒径增大。当PLGA用量为100 mg时,粒径(2.10±0.32)μm,微球的粒径分布较为均一,故选择100 mg PLGA用量进行后续实验。

2.1.5水相PVA质量分数的影响 PVA作为一种表面活性剂,可以使油水相界面更加稳定,从而影响微球的粒径[13]。考察了0.5%、 1.0%、 2.0%和3.0%的水相PVA质量分数对微球粒径大小及分布的影响,结果见图2(d)。随水相质量分数的增加,微球粒径反而减小,当PVA的质量分数为1.0%时,粒径(1.70±0.29)μm,微球的粒径相对均一,故选择1.0%的水相质量分数进行后续实验。

2.1.6Fe3O4@OA用量的影响 Fe3O4@OA纳米颗粒作为一种磁性功能材料,可以赋予微球靶向性。考察了20、 30、 40和50 mg的Fe3O4@OA用量对微球的粒径及均一性的影响,结果见图2(e)。随着Fe3O4@OA用量的增多,微球的粒径逐渐增大,这主要是因为微球中的磁性纳米颗粒存在相互作用。当Fe3O4@OA的用量为40 mg时微球粒径分布较为均一,粒径为(3.40±0.40)μm,故选择40 mg的Fe3O4@OA加入量进行后续实验。

2.1.7姜黄素用量的影响 姜黄素的用量直接影响了载药磁性微球的载药量和包封率,考察了5.1、 8.1、 10.0和13.0 mg的姜黄素用量对载药磁性微球的影响。姜黄素的加入对微球的粒径影响不大,平均粒径均约为3.00 μm,如图2(f)所示。但随着姜黄素的加入量增加,微球的载药量逐渐增加,包封率先增加后降低,如图3所示。这主要是因为载体材料PLGA对药物的包封能力有限,当超过限度,包封率会出现下降的趋势。当姜黄素加入量为10.0 mg时包封率最高,故选择较优条件为10.0 mg的姜黄素加入量。

图3 姜黄素用量对微球载药性能的影响Fig.3 Effect of curcumin dosage on drug loading performance

综上,制备微球的最优工艺条件为:选用搅拌-均质两步乳化法,高速均质转速为15 000 r/min,水油相体积比为10∶1,PLGA用量为100 mg,PVA的质量分数为1%,Fe3O4@OA的用量为40 mg,姜黄素的用量为10 mg,此条件下制得的微球包封率为97.09%,载药率为6.40%。

2.2 姜黄素/PLGA磁性微球的理化性能

2.2.1形貌分析 按照上述最优条件制备姜黄素/PLGA磁性微球,显微镜下观察到该微球表面光滑,粒径分布较为均一,如图4(a)和(b)所示。采用Image J软件测量微球粒径为(3.50±0.56)μm,通过激光粒度仪测得平均粒径为3.60 μm,粒径分布较窄,多分散性指数(PDI)为0.38。

图4 姜黄素/PLGA磁性微球的光学显微镜照片(a)、粒径分布(b)及磁滞曲线(c)

2.2.2磁感应强度 图4(c)为Fe3O4@OA和姜黄素/PLGA磁性微球在298.15 K下的磁滞曲线。由图可知,与Fe3O4@OA的饱和磁化强度(68.69 A·m2/kg)相比,姜黄素/PLGA磁性微球(14.12 A·m2/kg)明显下降。主要原因是聚合物对Fe3O4@OA的包覆,PLGA包覆层减弱了Fe3O4@OA纳米颗粒之间的相互作用,从而降低了聚合物磁性微球的饱和磁化强度,但是从图5可以看出目前的磁化强度仍然可以实现对微球的磁控。

a.0 min; b.1 min; c.3 min图5 姜黄素/PLGA磁性微球的磁吸附效果Fig.5 Magnetic adsorption effect of curcumin/PLGA magnetic microspheres

2.2.3热重分析 根据文献[14]报道,通过热重分析可以测定磁性微球中Fe3O4@OA的质量分数。控制热重分析条件为氮气气氛,25～650 ℃,升温速率为10 ℃/min。图6为Fe3O4@OA、姜黄素/PLGA微球和姜黄素/PLGA磁性微球的TG曲线。由图可知,随着温度的上升,样品逐渐失重。姜黄素/PLGA微球从250 ℃开始失重,当温度达到350 ℃时几乎完全分解。Fe3O4@OA纳米颗粒从160 ℃开始失重,此阶段为油酸的分解,当温度达到400 ℃时趋于平衡,剩余的物质为Fe3O4。通过式(4)计算得到,Fe3O4@OA纳米颗粒中油酸的质量分数约为11.88%,Fe3O4的质量分数约为88.12%。姜黄素/PLGA磁性微球从250 ℃开始失重,约300 ℃时趋于平衡,此时体系中有机物几乎完全分解,所剩质量为Fe3O4的质量,根据式(4)可以计算得到Fe3O4@OA纳米颗粒的质量(2.21 mg),Fe3O4@OA纳米颗粒占姜黄素/PLGA磁性微球(7.90 mg)的质量分数即为磁性微球含磁量,约为27.98%。

图6 不同样品的热重分析

2.3 姜黄素/PLGA磁性微球的体外释放

模拟人体正常生理环境及肿瘤外微环境的释药情况,释放结果如图7所示。

由于肿瘤细胞增殖速度很快,其无氧呼吸代谢产生乳酸等酸性物质,导致其内外环境pH值降低[15-16]。血液等正常体液环境的pH值为7.4,肿瘤细胞外微环境的pH值范围为6.5～7.2,肿瘤细胞内环境的pH值范围为4～6[15]。姜黄素/PLGA磁性微球作为一种注射制剂,存在环境主要是人体体液及肿瘤外微环境,因此,实验选用最优工艺条件制备微球在pH值7.4和6.5条件下进行药物体外释放。在药物释放的初期(1 h内),释药率分别为4.53%和1.38%,未出现突释现象,说明微球对药物的包裹性好,且微球表面吸附的药物量较少。释放168 h后,药物累计释放率分别达到了40.66%(pH值7.4)和80.75%(pH值6.5),表明姜黄素/PLGA磁性微球在酸性环境下比中性环境下释放更快,这主要是因为在酸性条件下PLGA的酯键更容易断裂,降解速率更快[16]。分析在pH值7.4条件下的释放曲线可知,释放408 h后,曲线平缓,说明该微球缓慢释放药物,有明显的缓释效果。

3 结 论

3.1创新采用搅拌-均质两步乳化法制备姜黄素/PLGA磁性微球,通过单因素试验优化得到的最优制备条件为高速均质转速为15 000 r/min,水油相体积比为10∶1,PLGA用量为100 mg,PVA的质量分数为1%,Fe3O4@OA的用量为40 mg,姜黄素的用量为10 mg。此条件下制备的姜黄素/PLGA磁性微球粒径相对较小,约为3.60 μm,分布较为均一,PDI达到0.38,包封药物的能力较强,包封率可以达到97.09%,且具有超顺磁性(含磁量约为27.98%)。可通过磁控靶向肿瘤组织,实现药物在病灶部位的富集。该方法只需要采用常规设备,操作简单且易于批量制备。

3.2体外释放结果证明姜黄素/PLGA磁性微球具有明显的缓释功能,释药168 h后,药物累计释放率分别达到40.66%(pH值7.4)和80.75%(pH值6.5),在药物递送系统方面具有极大的潜能。