邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯诱导人卵巢颗粒细胞系KGN细胞铁死亡的作用研究

丁慧敏，项雨，吴洪慧，徐天月，葛红山，3*

(1.南京中医药大学,南京 210023;2.泰州市人民医院,泰州 225300;3.大连医科大学,大连 116044)

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)作为聚氯乙烯塑料的增塑剂,约占全部邻苯二甲酸酯(PAEs)类增塑剂使用量的50%,被广泛应用于食品包装、儿童玩具、医疗用品等制造行业[1]。DEHP 可经胃肠道、肺和皮肤吸收,通常以胃肠道为主要吸收途径。进入人体的DEHP极少部分直接以原型形式经由尿液、粪便或者汗液排出体外[2],绝大多数可在肝脏和胃肠道中迅速水解代谢为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)[3]。MEHP极易在体内长期蓄积,因此,DEHP 在机体内的毒性作用主要是通过其代谢产物MEHP来实现[4]。研究表明 MEHP可对人体的生殖系统、内分泌系统、神经系统等多个组织系统具有毒性作用[5-8]。有研究报道,DEHP高暴露女性出现了受孕率降低、流产率增加、雌激素水平降低和排卵异常[9]。DEHP和MEHP已被证明可以诱导原始卵泡的消耗、性激素的产生减少、引起卵巢颗粒细胞凋亡[10-11]。然而,其影响雌性生殖的确切机制尚不清楚。

铁死亡是铁依赖的脂质过氧化物过度积累和活性氧(ROS)引发的一种新的细胞死亡调节形式,在形态学和生物化学方面不同于凋亡、焦亡或坏死等细胞死亡方式[12-13]。在生化方面,它表现为亚铁离子和ROS水平升高、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性下降,以及脂质代谢物清除不充分并在细胞内积累[13]。有研究表明MEHP暴露诱导Sertoli细胞铁死亡可能是其雄性生殖毒性的机制之一[14]。因此,本研究探讨MEHP是否可以通过诱导KGN细胞铁死亡参与其雌性生殖毒性的发生和发展。

材料和方法

一、实验材料

1.实验细胞:人卵巢颗粒细胞系KGN细胞(中乔新舟ZQ0916)由中乔新舟生物科技有限公司提供。

2.主要试剂和仪器:胎牛血清(FBS;Sigma,美国);DMEM/F12培养基(Gibco,美国);青霉素/链霉素(苏州新赛美);MEHP(MCE,美国);CCK8(同仁,日本);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天);酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)兔单克隆抗体(ab155282;Abcam,美国)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)兔单克隆抗体(ab125066;Abcam,美国)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)兔单克隆抗体(ab216876;Abcam,美国)、铁蛋白重链1(FTH1)兔单克隆抗体(ab65080;Abcam,美国)、β-actin兔单克隆抗体(4970;Cell Signaling Technology,美国);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉爱博泰克);全波段多功能酶标仪(BioTek,美国);倒置生物显微镜(DM i8;Leica,德国);Tanon 4800发光成像系统(上海天能)。

二、研究方法

1.KGN细胞系体外培养:KGN细胞系在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中置于37℃,5% CO2培养箱中培养。待细胞密度达80%后加入不同浓度MEHP处理24 h。

2.细胞活力的检测(CCK-8法):KGN细胞经计数后按照5×103/孔将KGN细胞悬液接种到96孔板中,24 h贴壁生长后,将MEHP药物以不同的浓度(0、100、200、400、800、1 600 μmol/L)配置在DMEM/F12培养基中,通过换液给予细胞药物处理。经24 h MEHP药物处理后,弃去细胞培养基并用PBS清洗1次,向每孔加入100 μl CCK8和培养基的混合物并将96孔板转入培养箱避光孵育2 h。孵育结束后使用酶标仪在450 nm波长处测量吸光度(OD值)。

3.蛋白免疫印迹(WB):将各组KGN细胞提取蛋白用BCA试剂盒测量各组蛋白浓度。采用12%的凝胶进行聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳,之后将蛋白转移至PVDF膜(Millipore,美国)上;用5%脱脂牛奶(北京索莱宝)室温封闭2 h,TBST(北京索莱宝)清洗3次;将膜分别与一抗[ACSL4(1∶10 000)、GPX4(1∶1 000)、SLC7A11(1∶1 000)、FTH1(1∶1 000)、β-actin(1∶4 000)]在4℃摇床孵育过夜;第2天用TBST清洗3遍,每次5 min;之后将膜与二抗[HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)]一起室温摇床孵育2 h;TBST清洗3遍,每次5 min;用特超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天)曝光显影。Image J 1.8.0.345软件用于检测条带的灰度值,以目的蛋白和内参条带β-actin灰度值的比值与对照组比较表示目的蛋白的相对表达水平。

4.细胞铁含量检测:将细胞弃去培养液,胰酶消化,PBS重悬成1 ml的细胞悬液,细胞计数仪测定每组细胞量,离心后向细胞沉淀中加入100 μl提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率200 W,超声3 s,间隔7 s;重复30次),于4℃、10 000 r/min离心10 min,取上清待测。按细胞铁含量检测试剂盒(北京索莱宝)说明书加入相应试剂,充分混匀,25℃静置显色10 min,于96孔板中测定510 nm处吸光值,分别记为A测定、A空白和A标准,计算ΔA测定=A测定-A空白、ΔA标准=A标准-A空白。细胞铁含量(ng/104cell)=27.922×ΔA测定÷ΔA标准

5.丙二醛(MDA)含量测定:将各组KGN细胞提取蛋白上清,用BCA试剂盒检测各组上清蛋白浓度。根据MDA检测试剂盒(上海碧云天)说明书配好MDA检测工作液。再取适量标准品用蒸馏水稀释标准品至1、2、5、10、20、50 μmol/L,设置空白对照,并在空白对照的离心管中加入0.1 ml裂解液,加入0.1 ml上述不同浓度标准品用于标准曲线绘制,加入0.1 ml样品进行测定,再加入MDA检测工作液0.2 ml混匀,沸水浴15 min。冷却至室温,3 500 r/min离10 min,取200 μl上清液加入96孔板,酶标仪测量532 nm下吸光度。通过标曲计算出样品溶液中的MDA含量后,以单位重量的蛋白含量(BCA法)来表示最初样品中的MDA含量(μmol/mg)。

6.细胞内ROS和超氧化物阴离子水平检测:细胞按照3×105/孔接种于6孔板,24 h贴壁生长后加入MEHP处理24 h,去除细胞培养液,加入1 ml 10 μmol/L活性氧荧光探针(DCFH-DA)和10 μmol/L超氧化物阴离子荧光探针(DHE)溶液,37℃细胞培养箱内孵育20 min,无血清细胞培养液洗涤细胞3次,在荧光显微镜下观察并拍照。

三、统计学分析

结 果

一、MEHP改变KGN细胞形态并抑制其活力

为了探究不同浓度MEHP对KGN细胞形态和增殖能力的影响,以MEHP为0(对照组)、100、200、400、800、1 600 μmol/L浓度进行分组,在细胞密度达80%时给药,于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。镜下观察结果显示,对照组KGN细胞形态正常,呈成纤维样或梭形并向周围伸出伪足;100、200 μmol/L MEHP处理后细胞形态无明显改变,400、800、1 600 μmol/L MEHP处理后细胞数量减少,逐渐皱缩变圆,失去梭形和伪足样结构,且随着浓度的增加,形态改变愈加明显(图1)。

图1 不同浓度MEHP处理后KGN细胞形态学改变(×100)

采用CCK-8检测了不同浓度MEHP对KGN的细胞活力和增殖能力的影响,结果显示,与对照组相比较,100、200 μmol/L MEHP处理组细胞活力无显著改变(P>0.05),400 μmol/L MEHP处理组细胞活力减少至对照组的70.3%,800、1 600 μmol/L MEHP处理组减少至对照组的40%以下(P<0.05)(图2)。即随着MEHP浓度的增加,KGN细胞的存活率逐渐下降,高浓度的MEHP可以抑制KGN细胞的增殖。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。图2 不同浓度MEHP处理后KGN细胞的存活率

二、MEHP对KGN细胞铁死亡相关蛋白表达水平的影响

为了研究MEHP对KGN细胞的影响,用0(对照组)、100、200、400 μmol/L浓度的MEHP处理细胞并检测铁死亡相关蛋白的表达变化。WB结果显示,100、200、400 μmol/L各组中的ACSL4蛋白表达随着MEHP浓度增加而增加,与对照组比较,400 μmol/L MEHP处理组ACSL4蛋白表达显著增加(P<0.05);与对照组比较,200、400 μmol/L MEHP处理组GPX4蛋白表达显著下降(P<0.05);与对照组比较,400 μmol/L MEHP处理组SLC7A11和FTH1蛋白表达均显著下降(P<0.05)(图3)。

A:WB法检测铁死亡相关蛋白的表达;B:ACSL4蛋白相对表达量;C:GPX4蛋白相对表达量;D:SLC7A11蛋白相对表达量;E:FTH1蛋白相对表达量。与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。图3 WB检测不同浓度MEHP处理KGN细胞铁死亡相关蛋白的表达

三、MEHP对KGN细胞铁含量的影响

与对照组比较,400 μmol/L MEHP处理组的细胞铁含量增加,差异具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

与对照组比较,*P<0.05。图4 MEHP处理后KGN细胞铁含量变化

三、MEHP对KGN细胞氧化应激的影响

MDA检测试剂盒分析结果显示,与对照组比较,400 μmol/L MEHP处理组细胞内MDA含量显著增加(P<0.01)(图5)。我们用DCFH-DA和DHE荧光探针检测了细胞内的ROS和超氧化物阴离子的水平,结果显示,MEHP处理后细胞内ROS和超氧化物阴离子水平升高(图6)。这表明MEHP使得KGN细胞氧化应激水平增加。

与对照组比较,**P<0.01。图5 MEHP处理后KGN细胞MDA含量的变化

Hoechst33342:蓝色荧光代表细胞核;DCFH-DA:绿色荧光代表ROS;DHE:红色荧光代表超氧化物阴离子。图6 MEHP处理后KGN细胞ROS和超氧化物阴离子水平的变化(免疫荧光染色 ×200)

讨 论

DEHP是目前应用最广泛的增塑剂,作为一种环境内分泌干扰物,其具有类雌激素作用,对人类和动物的生殖功能有损伤作用[15]。由于女性特殊的生理特点和生活习惯,DEHP暴露的机会明显高于男性。但是由于女性生殖系统相对复杂,因此DEHP和MEHP的雌性生殖毒性的研究少见报道。女性生殖发育和功能的异常,如子宫内膜异位症、各种妊娠并发症、流产和早产等,都证实与DEHP的暴露有关[16]。卵巢颗粒细胞的增殖和分化能调节卵泡的生长和成熟,其状态是决定卵泡最终命运的关键[17],且已有研究表明卵巢颗粒细胞可能是DEHP代谢产物MEHP的靶细胞[18]。因此,我们在体外通过人KGN细胞建立MEHP损伤颗粒细胞模型来探究DEHP对卵巢的损伤机制。

本研究发现,KGN细胞的活力和增殖能力随着MEHP剂量的增大而降低,细胞形态也发生明显变化,失去伪足样结构。我们还发现400 μmol/L的MEHP使得KGN细胞的ACSL4蛋白表达增加,GPX4、SLC7A11、FTH1蛋白表达水平均显著下降。ACSL4是脂质过氧化物产生的关键酶,也是铁死亡的生物标志物和敏感调控因子[19]。SLC7A11是System XC-的重要组成部分,其表达减少时,System XC-被阻断,谷氨酸与胱氨酸不能互换,导致细胞内谷氨酸堆积,GSH合成减少,进而导致GPX4活性下降[20]。GPX4是细胞内最重要的抗氧化物,它可以清除细胞内的脂质过氧化物,是调控铁死亡的关键蛋白[21]。MEHP通过ACSL4表达上调使脂质过氧化物产生增加,同时GPX4的蛋白表达和活性降低,无法及时清除脂质过氧化物,进而引起KGN细胞铁死亡抑制细胞增殖能力。

脂质过氧化和铁离子的蓄积是铁死亡的标志性特征[13]。外周循环中的Fe3+通过转铁蛋白和转铁蛋白受体的结合进入细胞,还原为Fe2+,多余的铁则储存在铁蛋白FTH1和FTL中。过量铁主要通过芬顿反应产生的活性氧而引发铁死亡[22],铁离子的水平与丙二醛、ROS等过氧化产物的产生量呈正相关。本研究结果显示,MEHP增加了KGN细胞的铁含量,MDA、ROS、超氧化物阴离子等也明显增加。铁自噬是细胞内铁离子释放的主要过程,对铁稳态的调节至关重要,其是由FTH1介导的[23]。MEHP可能通过激活铁自噬使得储存在FTH1的铁离子被释放成为游离铁,细胞内铁增加,进而通过芬顿反应产生大量活性氧引发铁死亡。

综上所述,本研究通过铁代谢、氧化应激和铁死亡调控因子蛋白表达的异常初步显示了铁死亡是MEHP诱导人卵巢颗粒细胞KGN细胞发生死亡的重要途径,为DEHP和MEHP的雌性生殖毒性机制研究开拓了新思路。但是本研究仅局限于KGN细胞,缺乏卵巢方面的研究,且仅涉及铁死亡的部分指标,具有局限性,其发生铁死亡的具体机制还有待进一步实验研究验证。