葡萄籽提取物通过NF-κB/TLR4信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护机制研究

2023-10-23 13:44徐沙丽张俊霞
中西医结合心脑血管病杂志 2023年19期
关键词:葡萄籽脑缺血低剂量

李 丹,徐沙丽,王 颖,张俊霞

脑缺血是由脑动脉狭窄或闭塞、脑动脉栓塞、血流动力学、血液学等多种原因导致的局部或多部位的供血不足性疾病,是一种常见病,供血及供氧减少会导致组织损伤及坏死,而脑缺血再灌注可能会进一步加重病情及功能紊乱,影响病人的预后及生活质量[1-2]。近年来,越来越多的研究显示,缺血并不是脑组织损伤的主要原因,而是由血供恢复后过量的自由基攻击重新获得血液供应的组织内的细胞造成的,称为脑缺血再灌注损伤[3-4]。研究显示,炎症与神经元细胞死亡和神经系统功能紊乱密切相关[5]。葡萄籽原花青素是从葡萄籽中提取的生物类黄酮,具有较强的清除自由基、抗氧化活性,可减轻脑缺血再灌注大鼠缺血区病理改变,减轻脂质过氧化,改善大鼠学习和记忆功能,发挥脑保护作用[6]。核转录因子-κB(NF-κB)在炎症发生过程中具有关键作用[7]。Toll样受体(TLR)是一种跨膜受体,而TLR4作为其中的一种亚型,主要识别不同的病原相关分子模式,进而导致炎性细胞分泌增加,引起全身炎症反应[8]。因此,本研究基于NF-κB/TLR4信号通路探讨葡萄籽提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠模型的影响并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物

8周龄SD大鼠40只,体质量(230±30)g,购自北京市华阜康生物技术股份有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2020-0004。饲养环境保持干燥、通风、安静,大鼠自由进食、饮水,室内温度22 ℃,相对湿度60%,适应性喂养2周。葡萄籽提取物(提取率为8%,原花青素含量为95%)购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司,批号:002-1503012-27。

1.2 试剂及仪器

苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自武汉百浩天生物科技有限公司;酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒购自四川迈克生物科技股份有限公司;白细胞介素(IL)-1β、IL-6检测试剂盒由广州新晋生物科技有限公司提供;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购自辽宁天医生物制药有限公司;B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)试剂盒、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)试剂盒均购自江苏睿捷生物科技有限公司;Caspase-3检测试剂盒购自广州铭安生物科技有限公司;TLR4、NF-κB p65及NF-κB p65一抗、二抗均购自深圳市益百顺科技有限公司;电子天平YP80001型购自河北传维化工有限公司;低温离心机(型号5810R)购自深圳诸夏科技有限公司;正置显微镜(GR-29J-2型)购自广东金相检测技术有限公司;电泳仪、转膜仪购自深圳市文乐生物科技有限公司;凝胶成像仪系统由北京华圣科仪实验设备有限公司提供。

1.3 动物分组、造模及给药

将40只大鼠随机分为对照组、模型组、葡萄籽提取物低剂量组及葡萄籽提取物高剂量组,每组10只。模型组、葡萄籽提取物低剂量组及葡萄籽提取物高剂量组参考文献[9]中的方法,采用改良线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。大鼠腹腔麻醉,固定于实验台,仰卧位,取颈正中切口,切开皮肤,钝性分离各层组织,分离右侧颈总动脉,向上分离右颈外动脉、颈内动脉,在近右侧颈总动脉分叉处约6 mm处结扎右颈外动脉,于右侧颈总动脉近心端夹动脉夹,在右颈外动脉近分叉处留置一打好结的丝线,不收紧线结,在右颈外动脉结扎处与分叉处之间做一直径约0.20 mm的V型切口,将尼龙线于结扎切口处轻轻插入,轻轻收紧线结,松动脉夹,将尼龙线顺大脑中动脉经颈内动脉送入颅内,插入深度约19 mm,微遇阻力时停止,使尼龙线头端位于大脑中动脉起始处,阻断大脑中动脉的血流。收紧丝线,海绵胶止血,缝合伤口,单笼饲养。对照组只进行麻醉和血管分离术,不结扎血管及导入线栓。采用Zea-Longa分级评分筛选造模成功的大鼠。葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组于建模成功后分别给予70、140 mg/kg葡萄籽提取物灌胃,对照组和模型组以2 mL/kg生理盐水灌胃,每日1次,连续灌胃7 d。

1.4 大鼠神经缺损情况

参照5分制评分法[10]评估各组大鼠神经功能变化情况,0分为活动基本正常,无明显神经病学症状;1分为左侧前爪无法完全伸展;2分为爬行时向左侧转圈;3分为行走时向偏瘫侧倾倒;4分为不能自动行走,有意识障碍。

1.5 大鼠脑组织病理改变观察

各组大鼠药物灌胃结束24 h后麻醉处死,取大脑组织,用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h,按照常规方法制成石蜡切片,使用HE染色观察大鼠脑组织病理切片。

1.6 ELISA法检测相关炎性因子水平

收集各组大鼠脑组织,转移至含1 mL蛋白酶抑制剂的PBS中,匀浆机研磨后充分匀浆,以12 000 r/min离心20 min,收集上清液,按ELISA说明书检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白表达量

将大脑组织剪碎,完成消化、电泳、转膜,加入一抗(Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白)孵育,第2天加入二抗孵育2 h,通过吸光度,以内参为β-actin获得Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白表达水平。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠精神状态及神经缺损评分比较

对照组大鼠活动正常,精神状态良好;模型组和葡萄籽提取物低剂量组大鼠精神状态不佳、不活跃,经常静止于角落;葡萄籽提取物高剂量组大鼠精神状态有较好改善,有少量活动。与对照组比较,模型组、葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠神经缺损评分升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠神经功能缺损评分明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与葡萄籽提取物低剂量组比较,葡萄籽提取物高剂量组大鼠神经功能缺损评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经缺损评分比较(±s) 单位:分

表2 各组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较(±s) 单位:pg/mL

2.2 各组大鼠脑组织病理变化比较

HE染色结果显示,对照组大鼠脑细胞正常;模型组大鼠脑细胞部分坏死,正常细胞大量减少,炎性细胞增多,出现脱片现象;葡萄籽提取物低剂量组与葡萄籽提取物高剂量组大鼠脑组织有脱片现象,与模型组比较,脱片现象、炎性细胞浸润明显减少。详见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理变化(HE染色,×400)

2.3 各组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

与对照组比较,模型组、葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组、葡萄籽提取物低剂量组比较,葡萄籽提取物高剂量组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表 2。

2.4 各组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达水平比较

与对照组比较,模型组、葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相对表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相对表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与葡萄籽提取物低剂量组比较,葡萄籽提取物高剂量组大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相对表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图2。

图2 各组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达条带图(A为对照组,B为模型组,C为葡萄籽提取物低剂量组,D为葡萄籽提取物高剂量组)

表3 各组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达水平比较(±s)

2.5 各组大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平比较

与对照组比较,模型组、葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠Bcl-2蛋白表达水平明显降低,Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠Bcl-2蛋白表达水平明显升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与葡萄籽提取物低剂量组比较,葡萄籽提取物高剂量组大鼠Bcl-2蛋白表达水平明显升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

缺血性脑血管疾病为临床常见疾病,复发率较高,严重威胁病人的身心健康和生命安全,且炎性因子对脑损伤具有重要影响[11-13]。脑缺血再灌注损伤防治一直是临床研究的重点和难点。本研究探讨葡萄籽提取物调控NF-κB/TLR4信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的保护作用。脑组织短暂缺血会引起脑缺血损伤,但当血液供应恢复后出现的炎性反应会对脑组织造成缺血再灌注损伤[14]。相关研究指出,NF-κB是重要的核转录因子,与局灶性脑缺血再灌注损伤后的免疫炎性反应密切相关,其作为炎症反应过程的调节中介物可介导TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的合成,促使局灶性脑缺血再灌注后脑组织损伤加重[15]。炎症反应是脑缺血再灌注损伤的病理机制基础,也是脑卒中发生的十分危险因素[16]。脑缺血再灌注后脑组织细胞受损,刺激分泌大量的炎性因子[17-18]。IL-1β是炎性反应中标志性的炎性因子,对炎症反应具有促进作用,当缺血性脑损伤发生时,激活免疫反应,进而诱发一系列级联反应,如炎性反应中TNF-α和IL-1β等的表达,加剧脑损伤[19]。IL-6由多类细胞分泌,也是一类促炎因子,在脑组织损伤中发挥作用[20-21]。TNF-α在脑缺血的早期介导炎症反应的发生[22]。本研究发现,低、高剂量的葡萄籽提取物能负调控脑组织中IL-1β、IL-6及TNF-α水平,表明葡萄籽提取物有一定的抗炎作用。

NF-κB在真核细胞内广泛存在,其对于机体的基因转录过程有重要调控作用,且与机体炎性反应、免疫应答、细胞凋亡等病理生理过程均密切相关[23]。研究显示,TLR4/NF-κB信号通路能刺激Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达,加快细胞凋亡[24]。本研究结果显示,葡萄籽提取物可以降低TLR4、NF-κB的蛋白表达,说明葡萄籽提取物可以负调控TLR4/NF-κB信号通路表达,降低凋亡蛋白表达,对损伤的大鼠脑组织具有保护作用,防止损伤病情的加重。研究表明,葡萄籽提取物具有调控TLR4/NF-κB信号通路的作用,与本研究结果[25]一致。Caspase家族是调控细胞凋亡的主要蛋白,包括Caspase-9、Caspase-3等[26]。当细胞凋亡程序启动,Caspase-3开始活化,进入细胞核,执行降解蛋白的作用,加快细胞凋亡[27]。本研究结果显示,与模型组比较,葡萄籽提取物低剂量组、葡萄籽提取物高剂量组大鼠脑组织中Caspase-3蛋白表达降低。李浩等[27]实验研究显示,原花青素可负调控凋亡相关蛋白表达,减少脑细胞凋亡,达到保护脑组织损伤的作用,与本研究结论一致。

综上所述,葡萄籽提取物可能通过调控NF-κB/TLR4信号通路促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax、Caspase-3蛋白表达,减少炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放,从而改善大鼠神经功能缺损及脑组织病理损伤,发挥其脑保护作用。

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