茶黄素对新生大鼠心肌缺血保护作用的机制研究

韩 旭,朱 萍,柳 旎,吴宗跃,杨 静

缺血性心脏病(IHD)是世界范围内的一种主要致死性疾病[1]。心肌缺血早期可能无明显症状,但随着病情的发展可能会导致严重的临床后果,对心脏造成损害[2-3]。新生儿发生心肌缺血可能会导致多个器官,尤其是大脑和心脏的缺血性损伤[4-5]。异丙肾上腺素(ISO)是一种β-肾上腺素能受体激动剂[6],过量的ISO可引起大鼠不可逆的急性心肌缺血损伤,是诱发大鼠心肌梗死的药物[7]。茶黄素是红茶中的天然多酚,包括茶黄素、茶黄素3-没食子酸酯、茶黄素3′-没食子酸酯和茶黄素3,3′-没食子酸酯[8]。研究显示,茶黄素具有抗高血糖症、抗炎和抗病毒的功效[9-12]。茶黄素由于具有超氧阴离子消除和金属螯合等功能,因此具有抗氧化作用,可介导内源性抗氧化剂系统并清除活性氧(ROS)[13-15]。研究表明,茶黄素可通过激活KATP通道,尤其是线粒体膜上的KATP通道来保护幼年大鼠心脏免于缺血/再灌注损伤,并抑制线粒体通透性转换孔道(mPTP)的打开[16]。本研究探讨茶黄素通过抑制氧化应激和细胞凋亡保护新生大鼠心肌缺血的机制研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7日龄无特定病原体(SPF)级新生Sprague-Dawley(SD)大鼠25只,购于成都市达硕生物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(川)2020-0039,适应性饲养1周后将大鼠随机分为对照组、ISO诱导组、茶黄素12.5 mg/kg组、茶黄素25.0 mg/kg组和茶黄素50.0 mg/kg组,每组5只[16]。心肌缺血模型构建后,将新生大鼠放至SPF环境独立通气笼(温度25 ℃,相对湿度40%～70%)中常规饲养,并由雌性大鼠进行母乳喂养。

1.2 心肌缺血模型的构建[17]

茶黄素12.5 mg/kg组、茶黄素25.0 mg/kg组和茶黄素50.0 mg/kg组分别腹腔注射茶黄素12.5、25.0、50.0 mg/kg预处理7 d,每日1次。除对照组外,其余各组新生大鼠在预处理最后2 d皮下注射ISO 85 mg/kg构建心肌缺血模型。

1.3 实验仪器与设备

AlphaImager HP凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司;FPMOUS-ECGenie小动物心电图监测仪购自孚光精仪(中国)有限公司;BX60型光学显微镜购自日本OLYMPUS公司;MyLab 30 CV彩色超声仪购自深圳百胜医疗科技有限公司(型号:MYLAB30CVVET);逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪(IQTM5型)购自美国Bio-Rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 超声心动图检测

2%异氟烷麻醉大鼠后使用配有10 MHz线性阵列的MyLab 30 CV超声系统进行超声心动图检查,并记录每只大鼠的心脏结构和功能参数,包括心率(HR)、左室壁相对厚度(LVWT)、左室收缩末期容积(LVESV)和左室射血分数(LVEF)。

1.4.2 苏木精-伊红(HE)染色

采用脊椎脱臼法处死大鼠后采集大鼠心肌组织进行HE染色(上海歌凡生物科技有限公司,货号M020),并于荧光显微镜下进行观察。

1.4.3 酶联免疫吸附法(ELISA)

眼眶取血获得外周血样品分离血清。根据ELISA试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)说明书检测血清肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)的表达水平。采用BIO-RAD酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测定光密度,使用ELISA试剂盒提供的细胞因子标准品建立测量的标准曲线。

1.4.4 蛋白免疫印迹法(Western Blot)

心脏组织加入液氮研磨,并用裂解缓冲液裂解后于4 ℃冷冻离心机以14 000 r/min离心15 min,形成浓缩蛋白质。取20 μg总蛋白进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,37 ℃下用5%的牛血清白蛋白封闭1 h,然后与抗Cleaved Caspase-9(1∶1 000,ab2324,Abcam)、Bcl-2(1∶1 000,ab32124,Abcam)、Bax(1∶1 000,ab32503,Abcam)、鼠双微体2基因(MDM2)(1∶2 000,ab226939,Abcam)、p53(1∶2 000,ab179477,Abcam)、磷酸化的核因子E2相关因子2(p-Nrf2)(1∶5 000,ab76026,Abcam)、血红素加氧酶1(HO-1)(1∶2 000,ab52947,Abcam)和NADPH奎宁氧化还原酶1(NQO1)(1∶10 000,ab80588,Abcam)在4 ℃孵育过夜。用TBS缓冲液洗涤后(含Tween-20的Tris缓冲盐水)加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反应1 h;洗膜后电化学发生(ECL)法曝光成像并应用quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。以上抗体均购于成都博奥维新生物科技有限公司。

1.4.5 免疫组织化学法

新生大鼠心肌用4%多聚甲醛固定24 h,包埋在石蜡中,切成薄片。将石蜡切片在二甲苯中分离,并在梯度乙醇中再水化。在10 mmol柠檬酸缓冲液中提取抗原后,将组织切片在3%H2O2中孵育10 min,并在室温下密封1 h。然后将心脏组织切片与兔抗Caspase-3抗体(1∶1 000,ab44976,Abcam)一起孵育过夜。将相应的第二抗体在室温下孵育1 h。在Olympus DX51荧光显微镜(Olympus,东京,日本)下观察图像。用Image 6.0分析数据。以上抗体均购于成都博奥维新生物科技有限公司。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心肌病理变化

HE染色结果显示,与对照组比较,ISO诱导组大鼠心肌间隙增宽,心肌细胞严重肿胀,附着炎性细胞增加,结构变得模糊。用茶黄素治疗后,与ISO诱导组比较,以上现象均得到缓解。详见图1。

图1 HE染色大鼠心肌病理切片(×400)

2.2 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心脏功能变化

与对照组比较,ISO诱导组HR、LVWT和LVEF均明显降低,而LVESV明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组HR、LVWT和LVEF明显升高,而LVESV明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组ISO诱导新生大鼠心脏功能变化比较(±s)

2.3 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心脏损伤标志物变化

与对照组比较,ISO诱导组cTnI、CK-MB和Mb含量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组cTnI、CK-MB和Mb含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 各组ISO诱导新生大鼠心脏损伤标志物变化比较(±s)

2.4 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心脏氧化应激变化

与对照组比较,ISO诱导组SOD含量明显降低,而MDA和MPO含量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组SOD含量明显升高,而MDA和MPO含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

表3 各组ISO诱导新生大鼠心脏氧化应激变化比较(±s)

2.5 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心脏细胞凋亡相关蛋白表达变化

与对照组比较,ISO诱导组Caspase-3阳性表达量明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组Caspase-3阳性表达量明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2、图3。

图2 免疫组织化学法检测Caspase-3阳性表达量

图3 各组Caspase-3阳性表达量比较(ISO诱导组与对照组比较,＊ P<0.05;与ISO诱导组比较,# P<0.05)

Western Blot试验结果表明,与对照组比较,ISO诱导组Cleaved Caspase-9/Caspase-9和p53的蛋白相对表达量明显上调,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相对表达量明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组Cleaved Caspase-9/Caspase-9和p53的蛋白相对表达量明显下调,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相对表达量明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4、图5。

图4 Cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax、MDM2和p53蛋白表达条带图

图5 各组cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bcl-2/Bax、MDM2和p53蛋白相对表达量比较(1为对照组;2为ISO诱导组;3为茶黄素12.5 mg/kg组;4为茶黄素25.0 mg/kg组;5为茶黄素50.0 mg/kg组。ISO诱导组与对照组比较,＊ P<0.05;与ISO诱导组比较,# P<0.05)

2.6 茶黄素治疗ISO诱导新生大鼠心脏核因子E2相关因子2(Nrf2)/HO-1/NQO1信号通路的变化

Western Blot试验结果表明,与对照组比较,ISO诱导组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相对表达量明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ISO诱导组比较,茶黄素25.0 mg/kg组、茶黄素50.0 mg/kg组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相对表达量明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图6、图7。

图6 Western Blot检测p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相对表达条带图

图7 各组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量比较(1为对照组;2为ISO诱导组;3为茶黄素12.5 mg/kg组;4为茶黄素25.0 mg/kg组;5为茶黄素50.0 mg/kg组。ISO诱导组与对照组比较,＊ P<0.05;与ISO诱导组比较,# P<0.05)

3 讨 论

左心室功能障碍与心肌梗死密切相关,最终可导致心室壁变薄[18-19]。心肌酶是心肌损伤的重要标志。本研究HE染色结果显示,与对照组比较,ISO诱导组大鼠心肌间隙增宽,心肌细胞严重肿胀,附着炎性细胞增加,结构变得模糊;在茶黄素干预后,与ISO诱导组比较,以上现象均得到缓解。与对照组比较,ISO诱导组HR、LVWT和LVEF明显降低,LVESV、cTnI、Mb和CK-MB均明显升高;在茶黄素干预后,与ISO诱导组比较,HR、LVWT和LVEF明显升高,LVESV、cTnI、CK-MB和Mb明显降低,表明茶黄素能够改善心肌缺血造成的心脏功能损伤。

凋亡在急性心肌梗死病人的心肌细胞死亡中具有重要作用[20]。研究表明,心肌缺血模型大鼠的氧化应激和心肌细胞凋亡会加剧[17,21];肿瘤抑制因子p53主要通过调节细胞凋亡、细胞周期阻滞、衰老、DNA修复和遗传稳定性来调节细胞的应激反应,负反馈调节主要由MDM2控制[22-23];MDM2通过至少3种机制控制细胞p53的水平和活性[24-25];另有研究表明,茶黄素可能通过下调多种丝裂原活化蛋白激酶途径来减轻乙醇诱导的胃黏膜上皮细胞氧化应激和凋亡[26]。在本研究中,与对照组比较,ISO诱导组Caspase-3阳性表达量明显上调,且Cleaved Caspase-9 和p53的蛋白相对表达量明显上调,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相对表达量明显下调;在茶黄素干预后,与ISO诱导组比较,Caspase-3阳性表达量明显下调,Cleaved Caspase-9和p53的蛋白相对表达量明显下调,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相对表达量明显上调,表明茶黄素能够改善心肌缺血造成的心脏细胞凋亡。在本研究中,与对照组比较,ISO诱导组SOD明显降低,而MDA和MPO均明显升高;在茶黄素干预后,与ISO诱导组比较,SOD明显升高,而MDA和MPO均明显降低,表明茶黄素可改善心肌缺血造成的心脏氧化应激。

Nrf2通过调节HO-1和NQO1等下游基因对氧化应激损伤发挥保护作用[27-29]。HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶和过氧化物酶1可消除活性氧[30-31]。研究表明,茶黄素可通过调控Nrf2信号通路减轻七氟醚引起的神经细胞毒性[32]。茶黄素还可通过激活Nrf2/NQO1/HO-1通路纠正线粒体功能障碍来抑制氧化应激和细胞凋亡,从而发挥抗肾脏缺血再灌注损伤的保护作用[33]。在本研究中,与对照组比较,ISO诱导组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相对表达量明显下调;在茶黄素干预后,与ISO诱导组比较,p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相对表达量明显上调,表明茶黄素可激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路改善心肌缺血造成的氧化应激。

综上所述,茶黄素可减轻ISO诱导新生大鼠心肌缺血,其机制可能与调节Nrf2/HO-1/NQO1信号通路、减轻细胞凋亡和氧化应激有关。