紫丁香苷对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护作用研究

胡闪闪，胡红杰，徐艳萍，何灵芝，卢玉洁，黄伊芹，程明，李恭贺，司红彬

(广西大学动物科技学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004)

肝脏对生命至关重要，是许多生理过程关键的枢纽，具有血容量调节、营养素代谢、免疫系统支持、脂质和胆固醇稳态、外源性化合物的分解等重要功能[1-2]。急性肝损伤是与高死亡率相关的一种严重综合征，多是由于脂多糖(LPS)和醋氨酚(APAP)等药物过量引起的[2]。过量药物在肝脏的代谢过程中会产生大量的活性氧自由基(ROS)，从而使谷胱甘肽还原酶(GSH)含量降低[3-4]，使肝脏产生大量的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎因子，这些促炎因子又可与炎性信号通路上的相关蛋白进行特异性结合，如与核转录因子p65(NF-κBp65)的特异性位点进行结合，促使NF-κBp65磷酸化发生核转移与DNA相应结构区域进行结合，进一步调节下游促炎因子转录，使炎性反应不断加强，炎性细胞因子不断释放导致细胞因子失衡和免疫功能障碍，进而损害肝功能[5-9]，危及生命健康。

紫丁香苷从刺五加中提取，现有研究表明紫丁香苷具有抗癌、抗氧化、免疫调节、保护肝脏、肾以及肺等药理功能[10-12]。作用机制均与消除氧化自由基、提高抗氧化物酶的活性、抑制机体炎性信号通路的激活、炎性因子的产生有关[13-15]，但有关紫丁香苷保肝作用的机制研究目前较少。本研究旨在通过建立药物性急性肝损伤模型，来探究紫丁香苷对于肝损伤小鼠的保护作用，并探究其发挥作用的潜在机制，为紫丁香苷的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

紫丁香苷(纯度98%，成都埃法生物科技有限公司)；LPS、D-半乳糖胺盐酸盐(D-GalN)购于阿拉丁；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)均购于南京建成生物科技有限公司；鼠源IL-1β、IL-6、TNF-α、ELISA试剂盒购于南京博研生物科技有限公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购于索莱宝；一抗(兔抗NF-κBp65)、二抗(山羊抗兔)，DAB显色液均购于赛维尔生物科技有限公司。

1.2 实验动物

40只SPF级昆明雄性小鼠，体重(22±2)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，在清洁级实验鼠房适应性饲养1周，12 h昼夜循环，饮水清洁充足，每天给予新鲜鼠粮，平均4 g/只，室温维持为(25±2)℃。

1.3 方法

1.3.1 分组与处理

随机将40只小鼠分为4组，每组10只：对照组(NC)、模型组(LD)、紫丁香苷低剂量(LSY+LD)组、紫丁香苷高剂量(HSY+LD)组。低、高剂量紫丁香苷组每天以25 mg/kg、50 mg/kg剂量通过腹腔注射给药，NC、LD组以同样的方式注射等量的生理盐水。在第3天腹腔给药1 h后，LD组、LSY+LD组、HSY+LD组腹腔给予LPS/D-GalN(30 μg/kg+250 mg/kg)，NC组给予生理盐水。LPS/D-GalN给药6 h后，小鼠眼球静脉采血，全血室温静置2 h后移置-4 ℃冰箱放置12 h，-4 ℃、3 000g离心机分离血清，分装并保存于-80 ℃；采取组织肝脏，称重，并在无菌生理盐水中快速冲洗，采取肝脏左侧小叶放入4%甲醛中固定，剩余肝脏分割放入EP管中，置于-80 ℃保存，以备后用。

1.3.2 血清及肝脏生化指标检测

根据试剂盒说明书检测血清中AST、ALT活性；肝脏组织中GSH水平，SOD、CAT活性。

1.3.3 ELISA法检测肝脏组织炎症因子水平

将相同质量的肝组织进行匀浆处理，并按照试剂盒说明书将匀浆进行相同倍数的稀释，然后检测肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3.4 肝脏组织病理切片

从固定液中取出肝组织，分割成小组织块，置于烧杯中流水过夜，并在梯度酒精中进行脱水，包埋，切片机连续切割5 μm厚的切片，60 ℃烘箱中烤片2 h，二甲苯中脱蜡，在梯度酒精中进行复水，采用苏木精伊红(HE)染色，分别在95%，100%的酒精中脱色1 min，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中分别透明两分钟，将切片放于通风箱中风干30 min，封片。

1.3.5 免疫组织化学分析

将组织切片进行上述的脱蜡操作后，在梯度酒精中进行复水；使用柠檬酸抗原修复缓冲溶液(pH = 7.4)加热进行抗原修复，3%双氧水溶液避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶；BSA封闭、一抗4 ℃孵育过夜，并用PBS洗涤3次(每次5 min)，二抗孵育50 min(HRP标记)；DAB显色、苏木素复染胞核3 min、自来水反蓝，封片。

1.3.6 数据分析

试验数据采用IBM SPSS Statistics 26进行单因素ANOVA检验；P<0.05表示差异显著；通过GraphPad Prism 8软件、ImageJ软件进行数据处理。

2 结果

2.1 紫丁香苷对小鼠血清AST、ALT活性的影响

由图1A可见，LD组小鼠与NC相比AST活性升高，且差异极显著(P<0.01)，LSY+LD、HSY+LD组与LD组相比AST活性显著降低(P<0.01)。由图1B可见，LD组与NC相比ALT极显著升高(P<0.01)，LSY+LD、HSY+LD组与LD组相比ALT降低，差异极显著(P<0.01)；HSY+LD组与LSY+LD组相比ALT差异极显著(P<0.01)，AST无明显差异。

LD组与NC组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；LSY+LD组或HSY+LD组与模型组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；

2.2 小鼠肝脏生化指标

SOD、GSH、CAT水平如图2所示。LD组与NC组相比小鼠肝组织中SOD和CAT活性、GSH含量降低，差异显著(P<0.05)；LSY+LD、HSY+LD组与LD组相比，SOD和CAT活性、GSH含量显著升高(P<0.05，P<0.01)；HSY+LD组与LSY+LD组相比SOD、GSH活性差异极显著或显著(P<0.05，P<0.01)，CAT活性无明显差异。

图2 SOD(A)、GSH(B)、CAT(C)在肝组织中的活性

2.3 小鼠肝脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的水平

小鼠肝脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的水平如图3所示。LD组与NC组相比小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差异极显著(P<0.01)；LSY+LD、HSY+LD组与LD组相比，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，差异显著或极显著(P<0.05，P<0.01)；HSY+LD组与LSY+LD组相比IL-1β差异极显著(P<0.01)，IL-6、TNF-α无显著差异。

图3 IL-1β(A)、 IL-6(B)、TNF-α(C)在肝组织中的表达水平

2.4 小鼠肝脏病理组织切片

小鼠肝脏病理组织切片观察结果如图4所示。NC组小鼠肝脏，肝细胞在肝窦，肝静脉周围呈放射状，且排列整齐；LD组小鼠肝脏细胞间出现严重瘀血，肝索紊乱，在肝管周围有大量的淋巴细胞；LSY+LD、HSY+LD组小鼠肝细胞形态随SY浓度增加逐渐趋于正常，淤血以及炎性浸润减少。

2.5 小鼠肝脏NF-κBp65免疫组化切片

小鼠肝脏NF-κBp65免疫组化检测结果如图5所示。与正常组相比，LD组核内NF-κBp65核表达量增加(P<0.01)，在LSY+LD组、HSY+LD组中核内NF-κBp65表达量降低(P<0.01)；HSY+LD组与LSY+LD组相比差异极显著(P<0.01)。

A.NC组；B.LD组；C.LSY+LD组；D.HSY+LD组

3 讨论

药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是由一些传统的化学药物、草药、膳食补充剂以及其他的外源性物质，通过不同途径进入体内；或药物代谢产物及由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低而导致的肝脏损伤、慢性肝炎、急性肝衰竭等肝功能异常的总称[18-21]。LPS/D-GalN联合给药可在短时间内引起严重的肝细胞炎症反应和过氧化应激反应，其病理特征与临床上病毒性肝炎所造成的损伤相似，因此，由LPS/D-GalN联合给药建造小鼠肝损伤模型，被广泛应用于保肝药物的研究。根据已有的文献，在LPS/D-GalN(30～100 μg/kg LPS+600～700 mg/kgD-GalN)联合给药剂量的基础上进行给药剂量的摸索[22-25]。研究结果表明，600～700 mg/kg的D-GalN药物剂量造成的肝损伤无法逆转，因此本试验降低D-GalN的给药剂量进行建模摸索。根据《药物性肝损伤基层诊疗指南》中肝细胞损伤型、混合型以及肝血管损伤型的模型评判标准，血清生化学特征ALT≥3倍正常上限(ULN)即证明肝损伤模型建立成功，最终确定以LPS/D-GalN(30 μg/kg+250 mg/kg)给药[26-29]。在本试验中，与NC组相比，LD组血清中AST、ALT的活性显著升高，且ALT≥3 ULN，LSY+LD组与HSY+LD组的AST、ALT的活性得到逆转，趋于正常水平；与LD组相比，紫丁香苷预防给药组随着给药剂量的增加，肝细胞在中央静脉周围的排列、形态逐渐恢复正常的放射状，炎性细胞数目减少，淤血减轻。正常生理情况下机体的抗氧化防御系统如SOD、CAT与GSH等可以消除过量ROS，避免肝脏的氧化应激反应，维持肝功能正常；但当肝功能受损时，抗氧化防御系统的激活受到抑制，过多的ROS无法被完全清除，从而在肝脏位置发生剧烈得脂质过氧化，进一步损害肝功能[30-32]。在本研究中，给予LPS/D-GalN后SOD、CAT活性降低，GSH含量降低，与现有研究结果相符合；与LD组相比，LSY+LD组、HSY+LD组的SOD、CAT活性升高，GSH含量上调，且具有剂量依赖性，证明SY可以通过激活机体的抗氧化防御系统，从而刺激抗氧化酶的产生，减轻机体的脂质过氧化。此外，LPS/D-GalN造成肝损伤另一主要原因是LPS与巨噬细胞表面的Toll-4(TLR4)受体相结合，通过TLR4/MYD88途径使得NF-κBp65亚单位S536发生磷酸化反应被激活，从而发生核转位与靶向的DNA结构域结合，调节下游炎性细胞因子的转录，从而造成炎性因子不可控的增加，如IL-6，IL-1β、TNF-α等炎性因子的剧增[33-37]。本文研究中利用总NF-κBp65抗体进行免疫组化，结果表明与NC组相比LD组NF-κBp65的核转移率增高，且与蓝染的细胞核颜色发生重叠呈现乌黑色，IL-6、IL-1β、TNF-α因子的表达显著升高；在SY的干预下NF-κBp65核转移率下降，IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著降低，证明SY可以通过抑制NF-κBp65的激活，抑制其发生核转移，从而抑制了下游的炎性因子的表达，降低肝脏的炎性反应。

综上，本试验结果显示紫丁香苷对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制NF-κBp65蛋白在肝脏的激活，抑制炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的产生，促进肝脏抗氧化酶的产生有关。