肌醇代谢调控因子IolR对嗜水气单胞菌碳源代谢及环境适应性的影响

徐蒙，李首纲，董雨豪，刘永杰

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)广泛分布于水体环境，是引起鱼类出血性败血症的主要病原，同时也是危害两栖类、爬行类以及哺乳类动物的重要病原。随着水产养殖业集约化和规模化程度的增加，该病害的持续发生，给我国的水产养殖业造成了巨大的经济损失[1- 2]。近年来，由嗜水气单胞菌引起的食物中毒、感染性腹泻以及继发感染等频繁发生，世界卫生组织将其列入饮用水病原体的检测范围，其致病作用已成为公共卫生所关注的重要问题[3-4]。

碳代谢是细菌最基础的代谢之一。碳源的获取对于病原菌在体内外环境中的生存尤为重要，不仅能为病原菌的生命活动提供能量，而且能为其生长提供物质基础[5-7]。病原菌可利用宿主内多种碳源，但由于特定栖居位点共存的其他微生物竞争，迫使入侵的病原菌通过基因水平转移获得新的代谢能力，最大限度地获取一切可利用的营养物质，以积极适应宿主体内的环境条件 (如低pH值、强氧化等)，并提高其在宿主体内的生存能力。前期研究证实，在嗜水气单胞菌ST251型菌株中均存在一个特有的肌醇代谢基因簇，位于由基因水平转移所获得的基因岛上，由12个基因组成[8]。李首纲等[9]已证实，肌醇代谢途径的阻断会严重降低嗜水气单胞菌NJ-35在鲫鱼体内的定殖能力以及对斑马鱼的致病力，推测肌醇代谢可能是决定嗜水气单胞菌毒力增强的关键因素。

IolR是调控肌醇代谢通路的一个重要的负调控因子。前期研究发现IolR不仅参与肌醇的代谢，还参与葡萄糖对肌醇代谢基因簇的转录抑制作用[10]，推测IolR在不同碳源代谢方面发挥重要作用。本研究在前期工作的基础上，测定ΔiolR缺失株对不同碳源的代谢能力，并且对ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化、耐高渗、抗吞噬以及耐药能力进行测定，探究IolR对嗜水气单胞菌碳源代谢以及环境适应性的影响，为进一步揭示IolR对嗜水气单胞菌环境适应性的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞

嗜水气单胞菌NJ-35(氨苄青霉素抗性，Ampr)(GenBank登录号：CP006870)、缺失株ΔiolR(Ampr)、互补株CΔiolR(Ampr)由本实验室鉴定保存。小鼠巨噬细胞RAW264.7购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM限制性培养基购自Meilunbio公司，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖过氧化氢酶、药敏片、Triton X-100、CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 均购自北京鼎国生物技术有限公司，氨苄青霉素购自Invitrogen公司，DMEM购自Gibco公司。

恒温摇床和恒温培养箱均为Thermo公司产品，微型离心机为Eppendorf公司产品，紫外分光光度计为Bio-Rad公司产品。

1.3 生长曲线测定

将野生株、ΔiolR和CΔiolR培养至对数期，调整各菌株浓度至OD600=1.0，按1∶100(体积比)转接至含不同碳源(终浓度为1%的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖)的DMEM限制性培养基中，28 ℃、180 r/min 震荡培养，每间隔1 h用分光光度计测量OD600值，绘制生长曲线。

1.4 抗氧化应激能力检测

分别挑取野生株、ΔiolR和CΔiolR单菌落于Luria-Bertani(LB)培养基中28 ℃、180 r/min 培养，待液体浑浊后转接至新鲜LB培养基中培养至对数期，5 000g离心5 min，弃上清液，用无菌PBS缓冲液3次，调节细菌浓度至OD600=0.1。加入H2O2至终浓度为2 mmol/L，吹打混匀，在28 ℃孵育1 h，加入2 000 U过氧化氢酶作用10 min终止氧化。用PBS进行10倍比稀释，取100 μL稀释液涂布含Amp (100 μg/mL)抗性的LB平板上，28 ℃培养16 h，选取菌落数在30～300个之间的平板进行菌落计数。

1.5 耐酸能力检测

将野生株、ΔiolR和CΔiolR培养至对数期，5 000g离心5 min，弃上清液，用pH值 5.0 的LB培养液重悬菌体，调节OD600=0.1，置于28 ℃ 摇床孵育30 min。PBS进行10×倍比稀释，取100 μL作用的稀释液涂布含Amp抗性的LB平板上，28 ℃温箱过夜培养，选取菌落数在30～300个之间的平板进行菌落计数，并计算存活率。

1.6 抗高渗透压能力检测

将野生株、ΔiolR和CΔiolR培养至对数期，5 000g离心后弃上清液，用氯化钠终浓度为0.2 mol/L的LB培养基重悬菌体并调整OD600=1[11]。向24孔细胞板每孔中加入1 mL上述培养液，按照1∶100(体积比)加入菌液，每株菌设置3个样品重复，每间隔1 h测量1次OD600值，绘制生长曲线。

1.7 抗吞噬能力检测

将野生株、ΔiolR和 CΔiolR培养至生长对数期，用PBS缓冲液洗涤3次，重悬于DMEM培养基中，以感染比(multiplicity of infection，MOI)为1∶1接种至形成单层的 RAW264.7细胞中，800g离心细胞板10 min。将细胞板置于28 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养1 h，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，加入含有100 μg/mL庆大霉素的DMEM，置于28 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养1 h，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，然后加入1 mL Triton X-100(浓度为0.1%)，室温裂解细胞10 min，吹打混匀，10倍比梯度稀释后涂LB固体平板，28 ℃培养18 h后，取菌落数在30～300个之间的平板进行计数。

1.8 细胞毒性检测

采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细菌对 RAW264.7的细胞毒性。试验参考CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)试剂盒说明书，并根据Erova等[12]的方法进行适当修改。细胞培养如前所述，试验在96孔细胞培养板中进行，共设置以下6个试验组：①细菌感染细胞后LDH释放组：以MOI=1∶1的比例加入制备的细菌悬液，每孔50 μL；②细胞LDH最大释放组：每个细胞孔中加入50 μL DMEM培养基；③细胞LDH自发释放组：每个细胞孔中加入50 μL DMEM培养基；④细菌LDH自发释放组：每个空白孔加入中50 μL DMEM培养基以及50 μL细菌悬液；⑤体积校正组：每个空白孔中加入100 μL DMEM培养基；⑥培养基背景对照组：每个空白孔中加入100 μL DMEM培养基。将所有试验组处理完后，25 ℃、800g离心细胞培养板10 min，将细胞培养板置于28 ℃，5% CO2环境中培养3 h，在培养结束前45 min，将10 μL裂解液加入到细胞LDH最大释放组和体积校正组中。800g离心10 min，每孔取出50 μL培养上清液至新的96孔细胞板中，每孔加入50 μL配制好的底物，室温避光孵育30 min。每孔中加入50 μL终止液，测定每孔液体的OD490值。按照公示计算细胞毒性：

细胞毒性=[(细菌感染组-细菌自发释放组-细胞自发释放组)OD值/(细胞最大释放组-细胞自发释放组)OD值]×100。

1.9 药敏试验

将细菌培养至对数期，调节至OD600=0.1。取200 μL菌液均匀涂布于LB琼脂平板，用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平皿表面并轻轻按压。28 ℃温箱培养24 h后测量抑菌圈直径。质控菌株为嗜水气单胞菌ATCC 7966。

1.10 统计分析

GraphPad Prism 8.3.0软件对试验数据进行分析处理，使用t检验进行差异显著性分析。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在不同碳源限制性培养基中生长能力检测

通过测定ΔiolR缺失株在不同碳源限制性培养基中的生长情况来评估IolR对不同碳源的代谢能力的影响。如图1所示，ΔiolR缺失株在以葡萄糖(图1A)、果糖(图1B)、甘露糖(图1C)和半乳糖(图1D)为单一碳源的培养基中生长速度均显著降低，表明IolR有利于葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖的代谢。

A. 葡萄糖为碳源；B. 果糖为碳源；C. 甘露糖为碳源；D. 半乳糖为碳源

2.2 iolR缺失对细菌环境适应性的影响

2.2.1 耐氧化应激能力

在LB培养基中添加终浓度为2 mmol/L的 H2O2，模拟强氧化条件进行测定。 结果如图2A所示，与野生株相比，ΔiolR缺失株的存活率降低58.98%(P<0.001)，且CΔiolR互补株的存活率恢复至野生株水平。表明IolR有利于嗜水气单胞菌的耐氧化应激能力。

A. 耐氧化应激能力；B. 耐酸能力；C. 耐高渗透压能力；

2.2.2 耐酸能力

采用LB培养基(pH=5)，模拟酸性环境进行测定。结果如图2B所示，ΔiolR缺失株的存活率显著低于野生株(P<0.05)，且CΔiolR互补株的耐酸能力恢复至野生株水平，说明IolR有利于嗜水气单胞菌的耐酸能力。

2.2.3 耐高渗透压能力

采用高渗透压条件(0.2 mol/L NaCl)培养野生株、ΔiolR和CΔiolR，观察生长情况。如图2C所示，在正常渗透压条件下，野生株和ΔiolR的生长速度基本一致；在高渗环境下，ΔiolR缺失株的生长速度略快于野生株(P<0.05)。说明IolR负向调控嗜水气单胞菌的耐高渗透压能力。

2.3 iolR缺失对细菌抗吞噬能力的影响

如图3所示，RAW264.7巨噬细胞对ΔiolR缺失株的吞噬率显著高于野生株，并且ΔiolR缺失株对巨噬细胞的毒性显著降低，表明IolR不仅有助于细菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用，还可以增强嗜水气单胞菌对巨噬细胞的毒性作用。

图3 野生株、ΔiolR和CΔiolR的抗吞噬能力(A)及细胞毒性(B)

2.4 药物敏感性检测

药敏试验结果见图4。由图4可以看出，ΔiolR缺失株对庆大霉素、妥布霉素、头孢曲松、头孢噻肟的敏感性显著强于野生株(P<0.001，图4A、图4B、图4C、图4D)，而对青霉素、恩诺沙星、复方新诺明、罗红霉素、诺氟沙星、万古霉素6种抗生素的敏感性均未改变(P<0.05)，见图4E、图4F、图4G、图4H、图4I、图4J，CΔiolR互补株的抗性均能恢复至野生水平，表明IolR的存在有助于嗜水气单胞菌抵抗庆大霉素、妥布霉素、头孢曲松、头孢噻肟4种抗生素的杀伤作用。

图4 野生株、ΔiolR和CΔiolR的药物敏感性

3 讨论

由于环境中的营养限制以及在宿主体内的营养竞争压力，迫使病原菌获得特定的代谢能力，进而克服营养限制。越来越多的证据表明，病原体已经开发出特定的肌醇代谢策略来克服这些限制，从而增强其在不同环境中的适应能力[13-14]。

前期研究发现在嗜水气单胞菌ST251型菌株中鉴定到一个特有的肌醇代谢基因簇，可用于肌醇的代谢[8]。肌醇是一种多元醇，广泛存在于机体的各种组织中，是维持机体正常生理功能必不可少的低分子有机物[15]。在水产养殖中，肌醇常作为营养促生长剂添加在饲料中，以提高饲料的利用率，降低鱼类的饵料系数，加快其生长速度[16]。IolR是调控肌醇代谢通路的一种重要的负调控因子，广泛存在于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)[17]、沙门菌(Salmonella)[18]、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)[19]、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)[14]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[13]以及猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)[20]中。IolR属于RpiR家族成员，该家族转录因子通常参与多种碳源的代谢。碳代谢是细菌最基本的代谢之一，碳源获取对于病原菌适应宿主体内的环境条件 (如pH值、渗透压等)，提高其在宿主体内的生存能力尤为重要。本研究结果显示，IolR有利于嗜水气单胞菌对葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等宿主体内常见碳源的利用。然而，Zhou等[17]研究表明，IolR的缺失可上调谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶ppgk基因和glk基因表达，从而促进葡萄糖的利用。有研究表明IolR可以通过激活剂或抑制剂双重身份参与靶基因的调控。例如，在谷氨酸棒状杆菌中，IolR既可作为肌醇代谢基因的抑制因子参与肌醇的利用，也可作为pck基因的激活因子参与糖酵解过程[21]。因此，推测IolR可能通过直接调控糖代谢相关基因的表达，从而参与嗜水气单胞菌对葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的利用。

除了获取营养物质外，病原菌在感染过程中还要应对宿主体内高渗透压、强酸等不利环境的刺激。Zhu等[22]研究发现，RpiR家族调控因子RpiRc的缺失可降低金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)对过氧化氢的敏感性。本研究对嗜水气单胞菌在高渗透压、强氧化以及强酸等环境的生存能力进行检测，结果显示iolR缺失后，嗜水气单胞菌的耐酸能力和抗氧化能力均显著下降，而耐渗透压能力略有增强，表明IolR在调控嗜水气单胞菌对不同胁迫环境的适应能力方面发挥重要作用。嗜水气单胞菌对酸性应激和氧化应激的耐受能力，对于其抵抗巨噬细胞的吞噬具有重要意义。Ma等[23]研究发现，RpiR家族调控因子AsiR的缺失可导致鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)在巨噬细胞中的存活能力增强。本试验检测了野生株、ΔiolR缺失株和互补株的抗巨噬细胞吞噬能力以及对巨噬细胞的毒性作用，结果显示，巨噬细胞对ΔiolR缺失株的吞噬能力显著增强，且其对巨噬细胞的毒力显著降低，表明IolR不仅有助于嗜水气单胞菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用，还可增强其对巨噬细胞的毒性作用。另外，通过差异转录组学分析发现，与野生株相比，ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化以及抗吞噬相关基因的转录水平均显著下调(待发表)，推测IolR可能直接参与耐酸、耐氧化以及抗吞噬相关基因的表达，但其具体作用机制有待进一步研究。

由于抗生素的滥用，水体环境已经成为自然环境中抗生素残留的主要载体之一，这就导致细菌长期暴露在低浓度的抗生素环境中，对细菌在水体环境中的生存造成极大威胁。本研究对水体环境中残留量较多的10种抗生素进行药敏分析，结果表明IolR有助于嗜水气单胞菌抵抗头孢噻肟、头孢曲松、妥布霉素、庆大霉素等4种抗生素的杀伤。细菌常见的耐药机制主要包括药物结合靶点突变、外排泵系统以及质粒介导的耐药基因水平转移等。差异转录组学分析发现，IolR的缺失可导致嗜水气单胞菌耐药相关基因的转录下调，并且凝胶迁移试验(EMSA)结果证实，IolR可以直接结合外排泵基因的启动子区域(待发表)，推测IolR可能直接调控外排泵基因的表达，从而降低药物的外排。

目前，对于IolR功能的研究主要集中在其作为负调控因子参与肌醇代谢。然而，本研究结果证实，IolR转录调控因子参与嗜水气单胞菌的耐酸、耐氧化、耐药、抗巨噬细胞吞噬以及碳源利用等重要生物学过程，表明该调控因子在嗜水气单胞菌的生存及环境适应性方面发挥重要作用。