霍山石斛不同部位总黄酮的含量比较及黄酮类成分分析

杨晓利，蒲天珍，李永华，陈畅，张秀桥，龚玲（湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065）

霍山石斛DendrobiumhoushaneneseC.Z. Tang et S.J. Cheng是兰科石斛属多年生草本植物，为2020年版《中国药典》石斛项下原植物之一，具有益胃生津，滋阴清热等功效[1]。霍山石斛因其特殊而严苛的生长环境，加之过度采挖，导致其野生资源濒临灭绝。霍山石斛传统入药部位为茎，在加工的过程中除去生物产量较大的叶、根等非药用部位。霍山石斛的主要化学成分包括多糖、黄酮、生物碱、氨基酸及微量元素等[2]，其中多糖类和黄酮类成分是其含量最高的主要活性成分[3]。已有研究[4-9]表明，石斛属植物中的黄酮及其糖苷类成分具有抗氧化、抗肿瘤、止血、免疫调节、抗阿尔兹海默症等药理作用，现已经被认为是其主要的药理活性物质之一。因此，有必要对霍山石斛不同部位中黄酮类化合物进行全面的分析研究，为霍山石斛的综合开发利用提供依据。超高效液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）技术灵敏度高、分离能力强、分辨率高，能快速地进行结构表征，有效提供化合物的结构信息，是一种高效的分析检测工具，目前已在天然药物的成分分析与鉴定方面得到广泛应用[10]。本实验测定了霍山石斛不同部位的总黄酮含量，并采用UHPLC-Q-TOF-MS技术，分析比较霍山石斛不同部位的黄酮类成分，以期获得霍山石斛不同部位的药效物质基础信息，为霍山石斛药用资源的扩大与进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器AT-201型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DHG-914385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；KX-350 型高速多功能粉碎机（浙江武义鼎藏日用金属制品厂）；KQ3200B 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；UVmini-1240紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；高分辨飞行时间液质联用仪（美国Waters公司）。

1.2 材料与试剂3 年生霍山石斛于2021 年9 月采自湖北省英山县霍山石斛种植基地，经湖北中医药大学药学院张秀桥教授鉴定为霍山石斛Dendrobium huoshaneneseC. T. Tang et S. J. Cheng。芹菜素对照品，纯度＞98%，上海胤珂生物科技有限公司，批号： 140312；甲醇为色谱纯，美国Sigma-Alorch 公司，批号：WXBC2770V；石油醚（30 ～60 ℃）、氯化铝、无水乙醇、甲酸，国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 霍山石斛样品清洗干净，将根、茎、叶分开，将茎剪成小段，将处理后的根、茎、叶于烘箱中60 ℃低温烘干，粉碎机粉碎为粉末，过60 目筛，-20 ℃保存备用。精密称取霍山石斛根、茎、叶的粉末各0.5 g，加入15 mL 石油醚，室温浸泡30 min，超声（100 W、40 Hz）提取30 min，滤过后取滤渣。待石油醚挥尽后，再加入80%乙醇25 mL，室温浸泡30 min，称质量，超声（100 W、40 Hz）40 min，取出室温放置冷却。再称质量，用80%乙醇补足损失的质量，摇匀。重复3次后过滤，取续滤液，即得根、茎、叶供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芹菜素对照品4.78 mg，用80%乙醇溶解，并定容至50 mL，摇匀，即得浓度为0.095 6 mg·mL-1的芹菜素对照品溶液[11]。

2.1.3 线性关系考察 精密量取芹菜素对照品溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4 mL 分别置于10 mL 容量瓶中，加入1% AlCl3溶液1 mL。再加入80%乙醇，定容，摇匀，室温静置15 min。以未加芹菜素对照品溶液为空白对照，紫外可见分光光度仪在波长415 nm处测定吸光度值[12-13]。以浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。

2.1.4 总黄酮含量测定 取3 批根、茎、叶粉末，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液。精密吸取1 mL分别置于10 mL容量瓶，按照“2.1.3”项下方法测定待测液中总黄酮含量。将吸光度代入标准曲线的回归方程中，计算得出各部位总黄酮含量。

2.2 成分分析

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称定霍山石斛根、茎、叶粉末各1 g，置于锥形瓶中，加入80%甲醇30 mL，室温浸泡30 min，称质量。超声（100 W、40 Hz）40 min，室温静置冷却。再称质量，用80%甲醇补足损失的质量，摇匀。重复3次后过滤，滤液用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.2 色谱条件 液相条件：色谱柱为Altima UHPLC C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：335 nm；柱温：35 ℃；流速：0.9 mL·min-1；进样量：2 μL；流动相：0.4%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～35 min，25%～45% B；35～50 min，45%～95% B；50～55 min，95%～95% B；55～56 min，95%～25% B；56～60 min，25%～25% B。

质谱条件：扫描范围（m/z）：100～1 200；采用加热电喷雾离子化源（H-ESI），负离子模式下采集数据；毛细管电压2.5 kV；样品锥孔电压30 V；脱溶剂气温度500 ℃；锥孔气的流量50 L·h-1；脱溶剂气流量500 L·h-1；离子源温度100 ℃；碰撞能量6.0 eV；分析时间60 min。使用MassLynx V4.1 软件处理数据。

3 结果

3.1 线性关系考察按照“2.1.3”项下操作绘制芹菜素标准曲线，得到回归方程Y=18.316X+0.001 5，r=0.999 9，结果显示在0.009 6～0.038 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

3.2 方法学考察

3.2.1 稳定性试验 精密称取霍山石斛叶粉末0.5 g，按“2.1.1”项方法下制备供试品溶液，分别在制备后间隔0、10、20、30、40、50、60、70 min 测定吸光度[14]。结果显示吸光度的RSD 为1.91%（n=8），表明样品在70 min内基本稳定。

3.2.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下霍山石斛叶供试品溶液，在波长415 nm 下连续进样6 次，分别测定吸光度。结果吸光度的RSD 为0.192%（n=6），表明该方法的精密度良好。

3.2.3 重复性试验 精密称取霍山石斛叶粉末0.5 g各6份，按“2.1.1”项下方法分别制备供试品溶液。精密吸取1 mL，于415 nm下测定吸光度。结果吸光度的RSD为2.55%（n=6），表明该方法重复性良好。

3.2.4 加样回收试验 精密称取已知含量的霍山石斛叶粉末0.5 g 各6 份，分别加入一定体积的芹菜素对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备溶液。精密吸取1 mL，按“2.1.3”项下方法测定吸光度。结果见表1。平均回收率为98.54%，RSD为1.10%（n=6）。

表1 霍山石斛总黄酮加样回收试验结果（n=6）Table 1 Results of recovery rate of total flavonoids in Dendrobium huoshanenese（n=6）

3.3 样品含量测定见图1。霍山石斛根、茎、叶3个部分总黄酮含量分别为0.477、0.630、2.06 mg·g-1。总黄酮在霍山石斛不同部位中的积累情况比较：叶＞茎＞根。其中，叶、茎部位总黄酮含量显著高于根部（P＜0.05，P＜0.01），叶中总黄酮含量又显著高于茎部（P＜0.01）。

图1 霍山石斛根、茎、叶总黄酮含量比较（n=3）Figure 1 Comparison of total flavonoids contents in roots，stems and leaves of D. huoshanenese（n=3）

3.4 成分分析应用UHPLC-Q-TOF-MS 技术，使用负离子模式[15-16]进行扫描，根据保留时间、分子离子峰、主要碎片离子峰、裂解规律，并结合相关文献结果[17]，最终在霍山石斛根、茎、叶中分别鉴定出53、61、68 种黄酮类化合物。霍山石斛根、茎、叶负离子模式下的总离子流图见图2。通过对霍山石斛的根、茎、叶中的黄酮类化合物进行鉴别，发现叶中的黄酮类化合物的数量是最多的。与叶相比，在根中未能鉴别出的化合物有15 种，分别是化合物34、53、56、37、65、67、68、57、62、63、64、66、40、49、60；在茎中未能鉴别出7种化合物，分别是化合物39、56、57、62、67、68、66。含量测定结果显示叶中总黄酮含量最高。因此，本研究重点阐述霍山石斛叶中黄酮类化合物的定性鉴别结果。见表2。

图2 霍山石斛根（A）、茎（B）、叶（C）负离子模式下总离子流图Figure 2 Total ion currents of D. Huoshanenese under negative ion mode in roots（A），stems（B）and leaves（C）

表2 霍山石斛叶的黄酮类成分鉴定结果Table 2 The identification results of flavonoid constituents in D. Huoshanenese leaves

3.5 化合物鉴定结果

3.5.1 黄酮氧苷类 在叶中鉴定出4 种黄酮氧苷类化合物，包括已被报道的柚皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷，以及推导得出的新橙皮苷。以化合物45新橙皮苷为例进行分析，保留时间17.16 min，母离子为m/z623 [M-H]-，可知其相对分子质量为624。推测其裂解途径为母离子失去一分子C14H28O72生成m/z315，表明该化合物的结构中有芸香糖基取代，其裂解规律与化合物异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷相同。结合相关文献报道[18]推断，该化合物为异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷的同分异构体新橙皮苷。其二级质谱图见图3，其余黄酮氧苷类化合物信息见表2。

图3 化合物45 的二级质谱图Figure 3 Secondary mass spectrum of compound 45

3.5.2 黄酮单糖碳苷 在叶中鉴定出7 种黄酮单糖碳苷类化合物。包括已经被报道的牡荆素-2”-O-鼠李糖苷、异牡荆素-2”-O-鼠李糖苷、金圣草黄素6-C-鼠李糖-（1→2）-六碳糖苷、芹菜素-8-C-鼠李糖-（1→2）-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-β-D-鼠李糖-（1→2）-阿拉伯糖苷，以及推导得出的金圣草黄素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷。以化合物53金圣草黄素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷为例进行分析。化合物53 的保留时间20.72 min，母离子为m/z577[M-H]-，可知其相对分子质量为578。推测其裂解途径为母离子分别失去一分子C3H6O3、C6H12O5和C6H10O4，生成m/z487、m/z413 和m/z431，m/z431进一步失去一分子C3H6O3生成m/z341，脱去一分子C2H4O2和一分子H2O 生成m/z371 和m/z353。推断化合物53 为金圣草黄素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖苷。其二级质谱图及可能的裂解过程见图4。其余未见报道的黄酮单糖碳苷化合物30、56信息见表2。

图4 化合物53 的二级质谱图（A）及可能的裂解途径（B）Figure 4 Secondary mass spectrum（A）and possible cleavage pathway（B）of compound 53

3.5.3 黄酮双糖碳苷 在叶中鉴定出57种黄酮单糖碳苷类化合物，推导得出可能的化合物共25 种，包括芹菜素-6，8-二-C-六碳糖苷、芹菜素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷、芹菜素-6，8-二-C-五碳糖苷、金圣草黄素-6，8-二-五碳糖苷等。以化合物33 芹菜素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖-8-C-五碳糖苷为例进行分析。化合物33 的保留时间12.88 min，母离子为m/z679 [M-H]-，可知其相对分子质量为680。裂解途径为母离子分别失去一分子C3H6O3、C2H4O2和C6H12O5生成m/z619、m/z589和m/z515，m/z515 进一步失去一分子C3H6O3生成m/z425，m/z425 分别失去一分子C3H6O3和C2H4O2生成m/z335 和m/z365。推断化合物33 可能为芹菜素-6-C-鼠李糖-（1→2）-五碳糖-8-C-五碳糖苷。其二级质谱及可能的裂解途径见图5。其余未见报道的黄酮双糖碳苷化合物2、4、5、29、33、34、35、36、37、40、41、49、52、54、55、57、58、62、63、64、65、66、67、68 信息见表2。

图5 化合物33 的二级质谱图（A）及可能裂解途径（B）Figure 5 Secondary mass spectrum（A）and possible cleavage pathway（B）of compound 33

4 讨论

本研究采用AlCl3比色法测定霍山石斛根、茎、叶3个部位黄酮类化合物的积累情况，结果显示不同部位中总黄酮的含量有显著性差异，黄酮的积累情况比较：叶＞茎＞根，且叶中总黄酮显著高于其他部位。通过UHPLC-Q-TOF-MS 对霍山石斛3 个部位黄酮类化合物进行定性鉴别分析，在负离子模式下叶中共鉴定出68 种黄酮类化合物、根53 种和茎61 种。在本研究中，从霍山石斛叶片中鉴定出68 种黄酮类化合物，其中64 种为黄酮碳苷，苷元主要有芹菜素、金圣草素及木犀草素。4种为黄酮氧苷，苷元为异鼠李素和柚皮素。连接糖基的类型有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等。在68 种黄酮类化合物中，已有23 种在霍山石斛中被发现，如新西兰牡荆苷Ⅰ[19]、夏佛塔苷[20]、异夏佛塔苷等[21]。有16种在石斛的其他品种中已报道，但在霍山石斛中首次被发现，如新夏佛塔苷[22]、佛莱心苷[23]、异佛莱心苷[24]等。而根据裂解规律首次推导获得的29 种黄酮类化合物，如新橙皮苷、木犀草素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷等在霍山石斛的成分研究中尚未见报道。而新橙皮苷具有抗炎活性[25]，木犀草素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷对肿瘤细胞具有抑制作用[26]。

本研究结果显示，与霍山石斛传统入药部位茎部相比，叶中的黄酮含量更高且数量更多，既丰富了霍山石斛黄酮类化合物的信息，也为减少霍山石斛加工过程中产生的资源浪费，提高非药用部位的利用，从而促进霍山石斛产业的绿色可持续发展奠定了理论基础。