黑老虎种子质量检验方法研究

曾伟光，刘情，刘舒璇，蔡桂泽，王杰鸿，覃仁安，陈明权，詹若挺，何瑞（. 广州中医药大学中药学院，中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 50006；. 广州白云山陈李济药厂有限公司，广东 广州 5088）

广东地区常用中药黑老虎具有行气止痛，通络散瘀等功效，来源于木兰科南五味子属植物黑老虎Kadsuracoccinea（Lem.）A. C. Smith 的根或藤[1]。黑老虎根、果实、种子富含木脂素类和三萜类化合物等成分[2-5]，同时其果实色艳、花多，枝叶常年绿色，适用于绿化园艺[6]。由于市场对药材的需求增加，野生黑老虎资源急剧减少[7-8]，近年来黑老虎成为南方规模化种植的热门品种。然而黑老虎繁殖效率低，药材产量低且差异显著[3]。性状稳定、质量优良的种子是规范化繁殖和生产优质、高产黑老虎的物质基础[9-10]。因此迫切需要参考《农作物种子检验规程》[11]，研究建立黑老虎种子检验方法和质量分级标准。

1 材料与方法

1.1 材料实验用黑老虎种子均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供，批号分别为：202011-A、202011-B、202111-A和202111-B，经广州中医药大学詹若挺研究员鉴定为木兰科南五味子属植物黑老虎Kadsuracoccinea（Lem.）A. C. Smith 种子。其中种子发芽条件优化所用种子（202011-A和202011-B）于2021 年1 月采购，其他试验所用种子（202111-A 和202111-B）于2021 年11 月采集。赤霉素（Gibberellic acid 3， GA3）、 红四氮唑（2，3，5- triphenyl tetrazolium chloride，TTC），上海麦克林生化科技股份有限公司；氯化钙（CaCl2），上海毕臣生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种子扦样和净度分析 参照GB/T 3543.1-1995《农作物种子检验规程》[11]执行。

1.2.2 种子播前处理方法考察及发芽试验 参照GB/T 3543.1-1995《农作物种子检验规程》[11]和黑老虎发芽相关文献，设计种子播前处理方法：a. 1% CaCl2+100 mg·L-1GA3溶液浸种12 h[13]；b. 30 mg·L-1GA3溶液浸种48 h[14]；c. 40 ℃纯水浸种2 h，室温纯水浸种10 h[15]。各处理方法均同时分别处理202011-A 和202011-B 两批种子100 颗。由于黑老虎种子营养极丰富[5]，种皮、种仁间常有空隙，难以彻底消毒。预实验发现，采用滤纸、湿砂等常用介质进行发芽，均出现种子严重霉变和腐败，无法完成发芽过程的情况，故选有机园艺土为发芽基质。播种后放置于常温（10 ～26 ℃）植物培养实验室中培养，发芽实验周期为两个月（2021 年2 月1 月至2021 年4 月1 日），定期观察，及时清除霉烂、坏死种子。发芽判定标准为2片子叶完全伸展及1片真叶芽。试验期间每隔5 ～7 d观察并记录1次发芽情况，试验结束后统计发芽率。

1.2.3 生活力测定方法 参照GB/T3543.1～3543.7-1995《农作物种子检验规程》实施指南[12]及种子生活力测定方法[15-17]，选用四唑染色法（Tetrazolium Test，TTC 法）对采收后冰箱冷藏6 周左右的202111-A 和202111-B 两批黑老虎种子进行生活力测定。称取适量TTC 溶于pH6.5～7.5 的磷酸缓冲液中配制成0.3%，0.6%和1.0% 的TTC 溶液[18]。以前期预实验确定的种子预措（去皮后穿刺）及预湿（室温纯水浸泡6 h）方法处理的种子为材料，设计L9（33）正交表（见表1），对染色温度、时间和TTC浓度进行考察。每实验4 个重复，每重复20 粒种子；热水煮沸一组10 粒种子作为对照。染色结束后，倒去TTC 溶液，纯水冲洗后观察。判断标准：结合对照组染色情况和正常处理后的种子胚染色程度来判断种子生活力，种子的胚及胚乳染成红色为有活力，胚及胚乳均不着色，或其中一部分不着色均为无生活力。计算染色率。

表1 TTC 染色法正交试验因素与水平表[L9（33）]Table 1 Factors and levels for orthogonal test of TTC staining[L9（33）]

1.2.4 贮藏条件和时间对黑老虎种子发芽率的影响将202111-A和202111-B两批次种子净选后各自分成两份，其中一份作为对照组，装入拉封袋敞开放置于无虫鼠害的干燥房间室温（10～26 ℃）保存；另一份于拉封袋中密封，存放于家用冰箱冷藏（6～8 ℃）。自存放起的2、4、6、8、13 周，取出种子，按“1.2.2”项下c 法处理种子，进行出苗实验，统计发芽率。

1.2.5 质量测定 根据GB/T3543.1～3543.7-1995《农作物种子检验规程》实施指南[12]，采用百粒法测定202111-A和202111-B两批黑老虎种子质量。同批次所有种子经过净度分析后，将全部净种子均匀混合后取其中一部分，从中随机人工数取8 个重复试样，每个重复100粒，分别称质量，换算成规定水分下的种子千粒重。

1.2.6 水分测定 根据GB/T3543.1～3543.7-1995《农作物种子检验规程》实施指南[12]，以及黑老虎种子挥发性物质含量较高的特性[5]，将种子粉碎至多于50%的粉碎物可通过4 mm 筛孔，采用低恒温烘干法测量水分。实验设置3 个重复组，每组取4.500～5.000 g，于（103±2）℃烘箱烘烤9 h[19]。烘干3 h 后每间隔1 h进行称质量，直至达到恒质量，达到恒质量前后的种子质量变化为种子失去的水分质量，即为种子含水量。

1.3 数据处理应用Microsoft Excel 软件和SPSS 26软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。主要计算公式如下：染色率（%）＝（染色数/种子总数）×100%；发芽率（%）＝（出苗数/种子总数）×100%；种子水分（%）=[试样烘前质量（g）-试样烘后质量（g）]/种子烘干前质量（g）×100%；千粒重（规定水分12%，g）=实测千粒重（g）×{[1-实测水分（%）]/[1-规定水分（%）]}。

2 结果

2.1 种子播前处理方法的筛选2021 年2 月，采用3 种播前处理方法对202011-A 和202011-B 两批次种子进行处理后播种，从播种当日起计，分别于第36 天、第42天、第49天以及第60天时共统计4次发芽情况。两批次黑老虎种子经3种方法前处理后的发芽率情况如图1所示，其中c方法（40 ℃纯水浸种2 h，室温纯水浸种10 h）为本试验中提高黑老虎种子发芽率的最优方法，且202011-B 批次在3 种前处理条件下种子的发芽率均高于202011-A 批次种子的发芽率，可见202011-B批次的种子活力要优于202010-A批次种子；同时可以确定黑老虎种子的出苗高峰期出现在播种后第42天以前。

图1 播种前处理对黑老虎种子萌发的影响Figure 1 Effects of pre-treatment on germination of K. coccinea seeds

2.2 种子生活力条件的优化在穿刺、预湿6 h 的条件下，采用L9（33）正交表，对温度、时间和浓度进行考察，以202111-A和202111-B两个批次黑老虎种子的染色率为指标判断种子生活力差异。结果表明，最佳的实验条件为种子去皮后穿刺、室温纯水浸泡6 h 后，采用浓度0.3%的TTC 溶液在40 ℃避光染色24 h；该条件下202111-B 批黑老虎种子染色率为85%，略高于202111-A批的80%。根据极差（R）的大小对各因素的影响作用进行判断（见表2），染色温度的R值最大（44.17），染色时间R值（37.50）次之，最低为TTC 浓度的R值（9.17），因此各因素对黑老虎种子生活力影响的大小排序为：染色温度＞染色时间＞TTC浓度。

表2 TTC 染色中正交试验因素与水平对黑老虎种子染色率的影响（ ±s）Table 2 Effects of orthogonal test factors and levels in TTC staining on the staining rate of K. coccinea seeds（ ±s）

表2 TTC 染色中正交试验因素与水平对黑老虎种子染色率的影响（ ±s）Table 2 Effects of orthogonal test factors and levels in TTC staining on the staining rate of K. coccinea seeds（ ±s）

实验组别实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9均值1均值2均值3极差（R）染色温度/℃30 35 40 30 35 40 30 35 40 27.50 55.00 71.67 44.17 TTC浓度/%0.3 0.6染色时间/h 1 1 6 6 6 0.3 0.6 0.6 1 0.3 50.00 56.67 47.50 9.17 12 12 12 24 24 24 30.83 55.00 68.33 37.50种子染色率/%202111-A批5.0 ± 4.1 60.0 ± 0.0 90.0 ± 4.1 30.0 ± 7.1 65.0 ± 0.0 70.0 ± 4.1 50.0 ± 7.1 70.0 ± 9.1 80.0 ± 4.1 202111-B批5.0 ± 0.0 10.0 ± 4.1 15.0 ± 0.0 15.0 ± 4.1 60.0 ± 4.1 90.0 ± 0.0 60.0 ± 16.3 65.0 ± 0.0 85.0 ± 9.1

2.3 贮藏条件和时间对黑老虎种子发芽率的影响将室温和冷藏的两批次黑老虎种子于不同时间取出，按前述c 法处理后进行出苗试验。随着储藏时间增加，室温储藏的两批次种子发芽率高低没有明显的规律，而冷藏的种子有先升高后降低的过程，冷藏6 周的两批种子发芽率均为最高。室温储藏8 周、13 周的种子没有萌发，而冷藏的种子仍有一定的发芽率，但都低于冷藏6周的种子，见图2。202111-A和202111-B 两个批次的黑老虎种子最高发芽率分别为57.7%、69.1%，202111-B 批次种子的发芽率较高，但二者的差异没有统计学意义（P＞0.05）。

图2 贮藏条件和时间对黑老虎种子发芽率的影响Figure 2Effects of storage conditions and duration on germination percentage of K. coccinea seeds

2.4 黑老虎种子含水量的测定结果从图3 可知，202111-A和202111-B两批黑老虎种子在105 ℃温度烘干过程中，前3 h 内水分含量下降很快，且202111-B 种子失水量显著高于202111-A 批次种子（P＜0.01）；3 h 后两批种子的失水曲线较平稳，在8～9 h 之间达到恒质量，这和《国际种子检验规程》中水分测定程序中规定的低温烘干的方法基本一致。故黑老虎种子的水分测定宜采用在（103 ±2）℃下烘烤9 h 的方法。实验测得202111-B 种子的含水量显著高于202111-A 种子含水量（P＜0.01），见表3。

图3 低恒温烘干法中两批黑老虎种子失水量变化趋势（n=3）Figure 3 Change trend of water loss using constant- lowtemperature oven method in two batches of the K. coccinea seed samples（n=3）

表3 两批次黑老虎种子含水量比较（n=3）Table 3 Moisture contents of two batches of K. coccinea seeds（n=3）

2.5 黑老虎种子千粒重的测定结果采用百粒法测定202111-A和202111-B两批黑老虎种子质量，计算均值，换算成含规定水分（12%）的平均千粒重。结果如表4 所示。两批种子千粒重（规定水分）分别为（208.21±0.73）、（201.72±0.57）g，变异系数分别为3.452、2.590，202111-A 和202111-B 两批种子千粒重之间没有显著性差异（P＞0.05）。

表4 两批次黑老虎种子的千粒重比较（ ±s，g）Table 4 The thousand-kernel-weights of two batches of seed samples（ ±s，g）

表4 两批次黑老虎种子的千粒重比较（ ±s，g）Table 4 The thousand-kernel-weights of two batches of seed samples（ ±s，g）

批次202111-A 202111-B千粒重最大值221.14 228.64千粒重最小值203.41 212.23千粒重均值210.97 218.18千粒重（水分12%）208.21 ± 0.73 201.72 ± 0.57

2.6 送验样品量根据本实验结果初步确定送验样品应含有不少于2 500粒种子，即按种子千粒重计算不得少于600 g。

3 讨论

近年来，以黑老虎根茎入药的中药材市场和果实食用的水果市场需求量日益增大，造成野生黑老虎资源的破坏性开采和种质资源流失[6-8]。又因其品种繁多，种子质量参差不齐，开展黑老虎种子检验规程研究，对保护黑老虎资源，规范黑老虎药材生产过程，从源头上保证黑老虎药材产量和质量具有重要的意义。黑老虎种子的土培发芽率可直接反应田间出苗情况，对其进行播种前处理方法的优化，能更好地提高其发芽率及生长量。根据相关研究[13-14]，低浓度GA3处理48 h后种子发芽率优于高浓度GA3处理12 h，增加浸种时间在一定程度上可以提高黑老虎种子的发芽率。此外，本研究采用中温水和冷水交替浸种的方法[15]，以40 ℃纯水浸种2 h后，换到室温下的纯水浸种10 h（c法），结果显示对两批次黑老虎种子的发芽率提高最明显，且在各个时间点下该方法处理后的发芽率均优于其他两种方法。

TTC 法是最常用、最方便的种子生活力测定方法，也是目前普遍使用的方法，适用于多种类型的种子测定[20-23]。本研究通过正交设计，优化了TTC法测定黑老虎种子生活力的温度、浓度、时间等实验条件；其最优条件为穿刺后预湿6 h，用0.3% TTC溶液于40 ℃避光染色24 h。在此条件下的测定结果显示，202111-B 批次的种子生活力（85%）略优于202111-A批次种子（80%），而202111-B种子的发芽率（69.09%）高于202111-A 种子（57.73%），可见TCC染色法测定的黑老虎种子生活力与其发芽率相关性较大。结合千粒重测定结果，从整体上反映出202111-B 批次种子的质量优于202111-A 批次种子。研究表明黑老虎种子具有物理和生理性休眠特性[23]，且各品种种子质量不一，发芽率差异较大；因此，通过TTC 法对黑老虎种子进行生活力测定，可以预测黑老虎种子发芽率，并对种子质量进行评价。

本研究结果表明，202111-B 种子发芽率明显高于202111-A 种子，而其实际含水量（18.64%）亦显著高于202111-A 种子（13.15%），提示对于黑老虎种子含水量较高有利于种子的发芽和出苗。同时，本实验对其不同温度及储藏方式进行了考察，发现常温存储8 周后，黑老虎种子的发芽率为0，而密封冷藏保存的种子仍有一定的发芽率，可见低温储藏对于黑老虎种子的发芽具有一定的积极作用，这与何铁定的研究结果相符[24]。其原因可能是黑老虎种子在收获时其种胚尚未完成后熟，采收后经过一段时间的低温层积，通过种胚增大完成形态及生理后熟，提高了其萌发率。但随着储藏时间的延长，冷藏8周后黑老虎种子的发芽率呈现下降趋势，这可能是因为随着冷藏层积时间的延长，种子内的营养物质被大量利用或被呼吸作用所消耗，使其发芽率降低。密封和冷藏同时满足了保存水分以及促进种子后熟的要求，在一定时间范围内，有助于提高黑老虎种子发芽率、保持种子的活力。

本研究对黑老虎种子的检验规程进行了初步研究，根据其特性建议采用土播出苗代替发芽实验，并通过对种子储藏的温度和时间对发芽率的考察，建议黑老虎种子的检验应在采收后的一定时间内尽早完成，为黑老虎种子的质量检验和储存管理提供了具有实践意义的参考。