安胃汤含药血清对胃黏膜肠上皮化生细胞内质网应激-自噬通路的影响

吴德坤，唐友明，郑景辉，覃树辉，莫少丹，黄敏燕，吕明艳，吴鸿运，梁柳观，胡鑫（. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 5300；. 广西中医药大学，广西 南宁 53000）

慢性萎缩性胃炎（Chronic atrophic gastritis，CAG）常伴有胃黏膜肠上皮化生（gastric intestinal metaplasia，GIM），属于胃癌前病变[1]，GIM是胃黏膜从良性向胃癌转变的关键环节[2-3]。研究[4-5]表明，GIM 患者发生胃癌的风险是正常人的10 倍，作为与肠型胃癌密切相关的癌前病变，干预GIM 是阻断胃癌发展的重要路径，是防治胃癌发生的关键。

安胃汤来源于名老中医林沛湘教授临床治疗慢性胃病的经验方剂[6]，具有消痞健胃、行气化湿、祛瘀止痛的功效。安胃汤临床治疗慢性胃炎、功能性消化不良、胃溃疡等消化系统疾病疗效显著[7-10]，能有效改善患者的中医证候及胃黏膜红斑、萎缩、肠化生等病变[11-13]。研究表明，安胃汤可逆转胃黏膜腺体萎缩、肠上皮化生以及异型增生[14]，下调胃黏膜TFF1、TFF2、TFF3 及NF-κB 蛋白表达[15-17]，上调胃黏膜GATA-4、GATA-5、GATA-6 mRNA 表达，发挥防治CAG 的作用[18]。研究[19-20]显示，在CAG、GIM以及幽门螺旋杆菌感染中均存在自噬机制且关系密切。研究[21]还发现，内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是幽门螺旋杆菌诱导自噬的重要途径。因此，本研究拟观察安胃汤含药血清对GIM 细胞的影响，并基于ERS-自噬通路探讨其作用机制，以期为安胃汤防治GIM的作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株人正常胃黏膜上皮细胞GES-1，购自广州赛库生物技术有限公司，货号：CC4026，置于液氮罐保存。

1.2 动物健康SD 大鼠20 只，雌雄各半，SPF 级，体质量（200±20）g，购自湖南天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0013，动物质量合格证号：430726220100091524，动物使用许可证号SYXK（桂）2019-0001。动物实验经过广西中医药大学动物福利伦理委员会审批，批文号：DW20210411-079。大鼠适应性喂养1 周后制备含药血清。

1.3 药物及试剂安胃汤处方：黄连3 g、制半夏9 g、干姜3 g、白芍10 g、百合10 g、乌药6 g、丹参10 g、薏苡仁15 g、甘草5 g、木香5 g，中药饮片均由广西中医药大学附属瑞康医院中药房提供，经广西中医药大学中药鉴定教研室滕建北教授鉴定为正品。取安胃汤处方剂量中药饮片，加入1 000 mL 蒸馏水，武火煮沸后转文火煎煮30 min，纱布过滤药液；同法再次煎煮，合并2次滤液，浓缩至含生药量为2 g·mL-1的安胃汤药液，备用。

鹅去氧胆酸（CDCA），上海麦克林生化科技有限公司，批号：C 804610；0.25% 胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司，货号：11011-8611；RPMI 1640 培养基，美国Gibco 公司，货号：C811875500BT； ATF6 兔多克隆抗体（货号：A00655）、VILLIN 兔多克隆抗体（货号：PB9457）、MUC2 兔多克隆抗体（货号：BM5029）、CDX2 兔多克隆抗体（货号：MA00877），均购自武汉博士德生物工程有限公司；GRP78 兔多克隆抗体（批号：ab103742）、LC3 兔多克隆抗体（批号：ab32516）、Beclin1 兔多克隆抗体（批号：ab101314），均购自英国Abcam 公司；Annexin V-PE 细胞凋亡检测试剂盒，美国BD 公司，批号： 559763；细胞周期检测试剂盒，江苏隆基生物公司，货号：KGA512；BeyoRTTMⅡcDNA 第一链合成试剂盒（RNase H-），上海碧云天生物技术有限公司，货号：D7168M。

1.4 主要仪器A2-6A1 型生物安全柜、CLM-170B-8-NF 型二氧化碳培养箱，新加坡ESCO 公司；TD5A-WS 型医用离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Countess II FL 型细胞计数仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；DMi8 型荧光倒置显微镜，德国Leica 公司；ChemiScope6200 Touc 全自动化学发光图像分析系统，上海勤翔科学仪器公司；FV3000 型激光共聚焦显微镜，日本Olympus 公司；CFX Connect型定时定量荧光PCR 仪，上海柏辰生物科技公司；HALO MPR96 型酶标仪，英国Dynamica 公司；Cytoflex 流式细胞仪，美国贝尔曼库特尔公司；PowerPac Universal通用电泳仪，美国伯乐公司。

1.5 安胃汤含药血清制备取健康SD 大鼠20 只，随机分为空白组及安胃汤低、中、高剂量组（5.4、10.7、21.4 g·kg-1·d-1），每组5 只。大鼠给药剂量参照人与大鼠体表面积比值计算。各组大鼠灌胃给药，每日1 次，连续7 d，空白组大鼠灌胃等容积生理盐水。大鼠末次给药前禁食不禁水12 h，给药2 h后用异氟烷麻醉，无菌条件下腹主动脉采血；静置2 h后，以3 040×g离心5 min，0.22 μm 滤膜过滤后分装至1.5 mL冻存管，-80 ℃保存备用。

1.6 GIM 细胞模型复制[22-23]常规方法培养GES-1细胞，取对数生长期细胞调整浓度为3×105个·mL-1；接种于6 孔板，每孔接种体积为2 mL；培养24 h后，更换为无胎牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养至细胞融合度达80%。将CDCA溶解至不含胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，加入GES-1 细胞培养孔，终浓度为150 μmol·L-1（经“1.7”项实验鉴定为最佳造模浓度），作为造模组；另设正常对照组，添加不含胎牛血清的RPMI 1640培养液，各组细胞培养24 h；造模成功后更换为正常培养液继续培养，用于后续实验。

1.7 GIM 细胞模型鉴定[24]采用Western Blot 法检测肠上皮细胞的特异因子MUC2、VILLIN、CDX2 蛋白表达情况，以鉴定GIM 细胞模型。GES-1 细胞培养及接种同“1.6”项，设置5个实验组，每组设4个平行孔；CDCA 干预浓度分别为0、50、100、150、200 μmol·L-1；药物干预24 h后，收集各组细胞，加入RIPA 充分裂解，以4 ℃、2 810×g离心5 min，收集上清液；采用BCA法测定总蛋白浓度。取40 μg蛋白加入缓冲液变性后，进行SDS-PAGE 电泳，转膜；用5%脱脂奶粉封闭后，分别加入1∶1 000 比例稀释后的相应一抗，4 ℃下孵育过夜；TBST 洗涤后，加入二抗，室温下孵育2 h；采用ECL 发光试剂在凝胶成像分析系统显影，扫描；采用ImageJ 软件对蛋白条带灰度值进行分析，以GAPDH 为内参，对目的蛋白表达水平进行半定量分析。

1.8 细胞分组及干预按照“1.6”项进行GIM 细胞模型复制，造模成功后继续培养至细胞融合度达80%；将细胞分为正常对照组（未经CDCA 干预的GES-1 细胞）、模型组及安胃汤低、中、高剂量组；正常对照组、模型组每孔加入2 mL 含10%空白血清的培养基，安胃汤低、中、高剂量组每孔加入2 mL含10%安胃汤低、中、高剂量含药血清的培养基；各组细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h。

1.9 MTT 法检测细胞增殖活力实验分组同“1.8”项，将各组细胞接种到96孔板，细胞浓度为1×105个·mL-1，每孔接种体积200 μL；置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养1～3 d；在细胞对数生长期，按照实验分组进行相应空白或含药血清干预，每组设6个平行孔；药物干预24 h 后，各孔加入浓度为5 mg·mL-1的MTT 溶液25 μL，继续培养4 h；吸弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，37 ℃下振荡10 min，采用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度值。

1.10 流式细胞术检测细胞周期分组及干预同“1.8”项，每组设4个平行孔。细胞培养24 h后，用胰蛋白酶消化细胞；收集细胞于离心管中，用预冷的75%乙醇在4 ℃下固定2 h；离心吸弃乙醇，细胞沉淀用PBS重悬洗涤；离心后保留细胞沉淀，向离心管内加入500 μL 提前配制的PI/RNase A 染色工作液，重悬细胞；室温下避光孵育30～60 min，同时设置未加染料的阴性对照组；采用流式细胞仪检测记录488 nm 波长处的红色荧光，利用Modfit LT 5.0软件分析处理数据。

1.11 流式细胞术检测细胞凋亡分组及干预同“1.8”项，每组设4个平行孔。细胞培养24 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞；室温下以2 810×g离心5 min，弃上清，用预冷的PBS 漂洗2 次后，加入100 μL Binding buffer重悬细胞；转移至5 mL流式管中，加入5 μL PE-Annexin V 和5 μL 7-AAD，室温下避光孵育15 min；每个流式管中加入200 μL Binding buffer，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.12 免疫荧光法检测细胞中ATF6 蛋白表达水平分组及干预同“1.8”项，每组设6 个平行孔。细胞培养24 h 后，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，室温下固定30 min；PBS 洗涤3 次，每次5 min，用200 μL 0.25% Triton X-100 在室温下透化10 min；PBS 洗涤3 次后，用山羊血清封闭30 min；弃去封闭液（不洗），加入1∶200 比例稀释的兔抗小鼠ATF6 一抗，4 ℃下孵育过夜；PBS 清洗3 遍后，加入Cy3 标记的荧光二抗，避光室温下孵育1 h；PBS 清洗3 遍后，滴加DAPI，室温下孵育10 min；PBS清洗3遍后，以水溶性封片剂封片；用激光共聚焦显微镜观察，阳性表达呈鲜红色，采用ImageJ 软件检测荧光强度，对结果进行半定量分析。

1.13 RT-qPCR 法检测细胞中GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表达水平分组及干预同“1.8”项，每组设4个平行孔。细胞培养24 h后，收集细胞于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol 裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA 浓度及纯度。按照逆转录试剂盒说明书步骤操作，进行逆转录反应合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，引物序列见表1。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s；60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Primers sequences for RT-PCR

1.14 Western Blot 法检测细胞中GRP78、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及 Beclin1 蛋白表达水平分组及干预同“1.8”项，实验方法同“1.7”项。

1.15 统计学处理方法采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验，若方差不齐则采用Dunnett’s T3法比较；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDCA 对GES-1 细胞MUC2、VILLIN、CDX2蛋白表达的影响结果见图1。与正常对照组（0 μmol·L-1）比较，CDCA 50 、100、150、200 μmol·L-1浓度组GES-1 细胞的MUC2、VILLIN、CDX2 蛋白表达均显著上调（P＜0.01），表明GES-1 细胞发生肠上皮化生。其中以150 μmol·L-1浓度组作用最佳，故采用150 μmol·L-1CDCA作为GIM细胞模型复制浓度。

2.2 安胃汤含药血清对GIM 细胞增殖的影响结果见图2。与正常对照组比较，模型组细胞的增殖水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组GIM 细胞的增殖水平均显著降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，安胃汤含药血清对CDCA 诱导的GIM 细胞具有增殖抑制作用。

图2 安胃汤含药血清对GIM 细胞增殖的影响（ ±s，n=6）Figure 2 Effect of Anwei Decoction-containing serum on the proliferation of GIM cells（ ±s，n=6）

2.3 安胃汤含药血清对GIM 细胞周期的影响结果见图3。与正常对照组比较，模型组细胞在G2/M 期的细胞比例显著升高（P＜0.01），在G0/G1 期和S 期的细胞比例明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组细胞在G2/M期的细胞比例显著降低（P＜0.01），在G0/G1 期和S 期的细胞比例显著升高（P＜0.01）。结果表明，安胃汤含药血清可将GIM细胞周期阻滞在S期，影响细胞周期运行，诱发细胞凋亡。

图3 安胃汤含药血清对GIM 细胞周期的影响（ ±s，n=4）Figure 3 Effect of Anwei Decoction-containing serum on GIM cell cycle（ ±s，n=4）

2.4 安胃汤含药血清对GIM 细胞凋亡的影响结果见图4。与正常对照组比较，模型组细胞的凋亡率显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，安胃汤含药血清能够诱导GIM细胞凋亡。

图4 安胃汤含药血清对GIM 细胞凋亡的影响（ ±s，n=4）Figure 4 Effect of Anwei Decoction-containing serum on GIM cells apoptosis（ ±s，n=4）

2.5 安胃汤含药血清对GIM 细胞ATF6 蛋白表达的影响结果见图5。与正常对照组比较，模型组细胞质及细胞核中的红色荧光显著减弱（P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组细胞质及细胞核中的红色荧光显著增强（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，安胃汤含药血清可上调GIM细胞中ATF6蛋白表达。

图5 安胃汤含药血清对GIM 细胞ATF6 蛋白表达的影响（免疫荧光染色，×400； ±s，n=6）Figure 5 Effects of Anwei Decoction-containing serum on protein expression of ATF6 in GIM cells（IF staining，×400； ±s，n=6）

2.6 安胃汤含药血清对GIM 细胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表达的影响结果见图6。与正常对照组比较，模型组细胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表达显著下调（P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组细胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表达均明显上调（P＜0.05，P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，安胃汤含药血清可上调GIM细胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA表达。

图6 安胃汤含药血清对GIM 细胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表达的影响（ ±s，n=4）Figure 6 Effect of Anwei Decoction-containing serum on the mRNA expressions of GRP78，LC3-Ⅱand Beclin1 in GIM cells（ ±s，n=4）

2.7 安胃汤含药血清对GIM 细胞GRP78、Beclin1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响结果见图7。与正常对照组比较，模型组细胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著下调（P＜0.01）。与模型组比较，安胃汤含药血清低、中、高剂量组细胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著上调（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，安胃汤含药血清可能通过上调GIM 细胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达，诱导细胞自噬与凋亡。

图7 安胃汤含药血清对GIM 细胞GRP78、Beclin1 及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达影响（ ±s，n=4）Figure 7 Effect of Anwei Decoction-containing serum on protein expressions of GRP 78，Beclin1 and LC3Ⅱ/Ⅰin GIM cells（ ±s，n=4）

3 讨论

中医将慢性萎缩性胃炎（CAG）归属于“胃脘痛”“痞满”“反酸”“嘈杂”等范畴，主要病因为外感六淫邪气、内伤饮食、情志郁结等导致脾胃升降失调、中焦气机不利[25-26]。CAG易伴发胃黏膜肠上皮化生（GIM）及不典型增生病变[27]。另外有研究发现，有36%的慢性浅表性胃炎（CSG）患者转变为GIM，1%转变为胃癌，CSG、CAG 和GIM 均是公认的胃癌前病变，严重危害人类的健康[28]。幽门螺旋杆菌（Hp）感染、胆汁反流是GIM 重要的发病因素，并且在癌变发展过程中起重要作用[29]。自噬在Hp 感染中的作用复杂，能够诱导自噬以促进其复制[30]。自噬在感染应答中具有调节免疫细胞效应物、细胞因子产生和控制炎症的关键作用[31]。研究表明，Hp 感染时内质网应激（ERS）水平明显降低，Hp 被根除后葡萄糖调节蛋白78（GRP78）上调，激发ERS[32]。安胃汤寒热并用，辛开苦降，具有止痛祛瘀、行气化湿、畅通气机、消痞健胃、平调寒热的功效，临床观察及实验研究[33-34]表明，安胃汤治疗Hp 阳性的CAG 伴GIM 疗效明显。本研究结果表明，安胃汤含药血清可上调CDCA诱导的GIM细胞GRP78 mRNA及蛋白表达，激发ERS诱导自噬。

细胞以分裂方式进行增殖，通过细胞周期表现形式来实现，细胞沿着G0/G1 期→S 期→G2/M 期→G0/G1 期的模式周期性运转，任何时期发生阻滞均可影响到整个细胞周期的进程，从而可能诱导细胞凋亡[35]。本研究结果显示，安胃汤含药血清可将GIM细胞周期阻滞在S期，并抑制其增殖，诱导其凋亡，且呈剂量依赖性。

内质网是真核细胞内重要的细胞器，具有最大的膜网络结构，主要参与蛋白质的修饰、加工以及新生肽链的折叠、组装和运输[36]。其内环境稳定对于维持细胞正常功能至关重要。GRP78 又称为BIP 或HSP5，属于热休克家族蛋白，参与细胞内蛋白折叠反应等过程，能促进正常生长状态下细胞蛋白质成熟，是维持细胞机能和生命的关键性调节物质，也是内质网中重要的分子伴侣。当内质网受到应激刺激时，会迅速激活GRP78 以结合内质网大量蓄积的未折叠或错误折叠蛋白，促进蛋白折叠和组装，降解错误蛋白，调节钙平衡。GRP78 在维持细胞内稳态过程中，与激活转录因子6（ATF6）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）以及肌醇需要的核糖核酸内切酶1α（IRE1α）3 个ERS 传感器结合，控制ERS 传感器的激活，因此高表达的GRP78 可作为ERS 的分子标志[37-39]。ATF6 是内质网的感受蛋白，属于亮氨酸拉链转录因子家族成员，在ERS 中扮演重要角色。在ERS 状态下，GRP78 与蛋白结合的同时释放ATF6，介导下游的凋亡途径[40]，ATF6 通路与多种疾病的发生密切相关[41]。本研究结果表明，安胃汤含药血清可通过上调GIM 细胞GRP78、ATF6 蛋白表达，激发ERS。

细胞自噬有利于维持基因的稳定性和损害DNA的修复[42]，是一个复杂的、多步骤的细胞自降解过程，在细胞物质周转过程中，既可降解受损细胞器和错误折叠蛋白，又参与细胞生理代谢，并在生长发育、饥饿适应、宿主-病原体相互作用、细胞死亡以及肿瘤抑制等方面起重要作用[43]。微管相关蛋白1轻链3（LC3）是一种成熟的自噬标记[44]，主要表现为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两个亚型。LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺缀合成为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ与自噬小体的外膜及内膜结合，从而诱导自噬发生[45]。自噬效应蛋白Beclin1是一种自噬调控因子，既可以调节自噬活性，也可以参与自噬体的形成[46-47]。Beclin1除了作为自噬的特异性基因，还是一种抑癌基因，对肿瘤有抑制作用。自噬在肿瘤发生发展中起着重要作用，且该作用具有两面性，对于癌前病变的自噬作用是一种抑制肿瘤发生的因素，而肿瘤一旦形成后细胞自噬又转化为促进肿瘤生长的因素。Beclin1 作为一个可靠的胃癌预后指标[48-49]，Beclin1高表达有助于胃癌患者的预后， Beclin1低表达与胃癌转移及低分化关系密切，同时Beclin1 在癌前病变、胃癌中的蛋白表达下调。本研究结果表明，CDCA 诱导的GIM 细胞中Beclin1 蛋白表达下调，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值降低，而给予安胃汤含药血清干预后，可以明显上调Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表达，升高LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比值。

综上所述，安胃汤含药血清可将CDCA 诱导的GIM细胞周期阻滞在S期，并抑制其增殖，诱导其凋亡，可能与其调控ERS途径，诱导细胞自噬相关。